[發明專利]一種抗Her2抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202011472883.8
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112979806A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 張國華;申陽陽;梁華斌;王龍超;李秀莉;胡桂珍;許可;王丹丹;徐明波
• 申請（專利權）人: 北京雙鷺生物技術有限公司;北京雙鷺藥業股份有限公司;北京雙鷺立生醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種Her2抗體的制備方法。本發明實施例的純化方法充分利用目的蛋白與雜質的表面電荷、分子量大小等差異，先通過一個陰離子交換層析串聯proteinA親和層析，有效去除宿主蛋白、外源DNA，增加工藝的可控性；再通過進一步陽離子交換層析進一步提純。本工藝不僅有效去除產品、工藝相關雜質，簡化了工藝步驟，縮短工藝周期，易于控制，便于操作，重復性較好。工藝穩定、可控，適合規模工業生產。

技術領域

本發明實施例涉及生物工程技術領域，具體涉及一種抗Her2抗體的制備方法。

背景技術

人類表皮生長因子受體2（縮寫Her2）屬于人表皮生長因子受體家族，是由ERBB2基因編碼的蛋白。Her2在正常細胞中表達水平極低，過量表達導致細胞增殖、分化、發育等功能紊亂，與腫瘤發生有密切關系。有20%左右乳腺癌會發生Her2基因擴增或過表達，成為乳腺癌治療的主要靶點。目前已上市的Her2治療性抗體曲妥株單抗（又稱赫賽汀），1998年Genentech通過FDA批準上市銷售，成為乳腺癌治療的一線用藥。

在抗Her2抗體的制備純化過程中，需有效去除聚集體、片段、外源DNA、宿主蛋白等。抗體的注射劑量較大，嚴格控制工藝相關雜質、產品相關雜質，是抗體制備純化的主要技術難點。在低pH孵育后pH回調，一般在5.0～7.0，正處于宿主蛋白的等電點附近，導致料液渾濁甚至沉淀，對后續離子交換和工藝放大都有不利影響，導致目的蛋白損失。

發明內容

本發明所解決的技術問題為針對抗Her2抗體純化方法的問題，提供了一種her2的純化方法，將陰離子交換層析與proteinA親和層析串聯，將傳統工藝步驟由三步減為兩步。以解決現有技術中操作步驟多，收率低，proteinA載量低，收率損失嚴重，工藝時間較長的問題。提高了生產效率，十分適合規模化放大生產。

實施本發明病毒滅活及過濾等步驟，可以采用CN201110452837、US6719971中公布的方法來進行。

該方法的主要步驟在于：將經過深層過濾的細胞表達上清，順序通過陰離子交換層析柱與proteinA親和層析層析柱串聯層析系統，利用內毒素、宿主蛋白與陰離子高吸附作用達到去除內毒素、宿主蛋白的目的。

之后采用低pH的緩沖液對親和層析柱單獨進行洗脫，收集洗脫后的目的蛋白。

本發明的具體處理步驟如下：

含抗Her2抗體的細胞發酵液，經過深層過濾，濾膜為pall SC050PDH4濾膜，得到細胞上清。緩沖液為pH6.0~7.5，濃度10mmol/L~100 mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡；

上清液順次通過陰離子交換層析柱與proteinA親和層析柱串聯層析系統，使內毒素和宿主蛋白結合到陰離子交換層析柱上，至上樣完畢。

采用低pH緩沖液單獨對proteinA親和層析柱進行洗脫，收集目的蛋白液；

洗脫后的目的蛋白經陽離子交換層析，獲得高純度的蛋白樣品。

所述陰離子交換層析柱與proteinA親和層析柱串聯層析層析條件為：180~300cm/h，柱高：15~20cm，平衡緩沖液為：pH6.5~7.5，濃度10mmol/L~100 mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡。pH3.0~3.6， 10mmol/L~100 mmol/L檸檬酸或甘氨酸洗脫；

陰離子交換層析為：、聚甲基丙烯酸脂類，配基為伯銨基或高流速瓊脂糖凝膠類，配基為N-芐基-N-甲基乙醇胺或陰離子復合膜。

陽離子交換層析條件為：200~400cm/h，柱高：15~20cm，平衡緩沖液為：pH5.0~5.5，濃度10mmol/L~100 mmol/L磷酸鹽或檸檬酸緩沖液，洗脫液：pH6.0~6.5，濃度10mmol/L~100mmol/L磷酸鹽或醋酸鹽緩沖液，加氯化鈉100~300 mmol/L。