[發(fā)明專利]一種大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法

有效

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• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112616659B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設計）人: 周艷威;陳紅;張凡;陸小清;李云龍;王傳永;李乃偉;蔡小龍;種昕冉;周婷
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天;邢少華

本發(fā)明公開了一種大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，屬于林木細胞工程快繁技術領域。該方法利用大別山冬青自然授粉半同胞家系的果實，分離出未成熟合子胚進行體細胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)。包括大別山冬青未成熟胚的準備、胚性愈傷組織誘導、胚性愈傷組織維持與增殖階段、體細胞胚誘導培養(yǎng)和體細胞胚的萌發(fā)、再生植株的煉苗和移栽。本方法繁殖系數(shù)高，增殖效果良好，繁殖不受季節(jié)限制，解決了大別山冬青播種繁殖需1?3年時間長的問題，不僅有利于大別山冬青遺傳資源的保存，而且為加速大規(guī)模冬青屬樹種無性繁育提供了一種周期短、繁殖率高且成本低廉的方法，也為建立更加高效的大別山冬青遺傳轉(zhuǎn)化受體體系提供了參考。

技術領域

本發(fā)明屬于林木細胞工程快繁技術領域，具體涉及一種大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法。

背景技術

大別山冬青(拉丁名：Ilex dabieshanensis K.YaoM.B.Deng)，冬青科冬青屬常綠闊葉喬木，原產(chǎn)安徽、湖北等大別山地區(qū)，為天然雜交樹種，1987年由江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)植物分類專家姚淦和鄧懋彬發(fā)現(xiàn)并定名，是華東、華中地區(qū)重要的園林景觀及茶飲、藥用經(jīng)濟樹種之一。大別山冬青葉色青翠，果實紅艷，生長勢旺盛，耐修剪，適應性廣，對土壤的質(zhì)地要求不嚴，山上、露地、微酸均能適應，耐瘠薄，栽培中未見明顯病蟲害發(fā)生，抗旱和耐高溫，葉片保健價值高，可作保健飲料、藥材等的原料。木材材質(zhì)優(yōu)良，可作家具貼面板等。

目前大別山冬青大規(guī)模繁育主要采用播種育苗，由于其種子具有綜合性休眠特征，一般發(fā)芽需2年以上時間。并且大別山冬青是天然雜交樹種，實生后代會產(chǎn)生大量變異，難以保持母株優(yōu)良性狀，不足以短期滿足苗木市場的巨大需求。因此，有必要研究大別山冬青優(yōu)良種質(zhì)資源快速大量繁殖的技術。而體細胞胚胎發(fā)生具有誘導數(shù)量多、成苗率高、生長周期短、遺傳特性較穩(wěn)定、不受地區(qū)、季節(jié)等自然條件的限制等優(yōu)點，已在230多個科，460多個植物中實現(xiàn)，是目前最具有廣闊應用前景的快速繁殖手段。

雖然大別山冬青目前有組織培養(yǎng)相關報道，但其增殖率均不高，僅為4-6，大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生技術的建立，不僅可以解決目前傳統(tǒng)組織培養(yǎng)增值率低的困難，而且可以實現(xiàn)大量繁殖優(yōu)質(zhì)種苗，更有利于優(yōu)良種質(zhì)資源的保存、繁殖以及遺傳改良等研究。因此，開展大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生研究，克服現(xiàn)有技術的不足，是十分有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

一種大別山冬青體細胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，包括以下步驟：

1)采集大別山冬青自然授粉半同胞家系的果實，取發(fā)育至早期子葉胚階段的大別山冬青核果，經(jīng)表面滅菌后，分離出未成熟合子胚；

2)在無菌條件下，將未成熟合子胚接種至誘導固體培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)獲得胚性愈傷組織；

3)在無菌條件下，將步驟2)誘導獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入維持和增殖培養(yǎng)基中形成緊實、致密的胚性愈傷組織；

4)在無菌條件下，將步驟3)獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入體胚誘導培養(yǎng)基中至子葉胚成熟后，將成熟的子葉胚轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基中直至萌發(fā)長成完整的再生植株；

5)再生植株的煉苗和移栽。

進一步的，步驟1)中，在采集大別山冬青自然授粉半同胞家系的果實，取發(fā)育至早期子葉胚階段的大別山冬青核果，經(jīng)表面滅菌后，分離出未成熟合子胚時，按照如下步驟進行：采集大別山冬青全紅果實，置于4℃條件下冷藏保存，然后揉搓去掉果皮和果肉，并在流水下沖洗得到干凈的核果；取發(fā)育至早期子葉胚階段的大別山冬青果實，經(jīng)過75％乙醇和2％次氯酸鈉溶液表面滅菌后，在無菌條件下取出合子胚，獲得無菌合子胚備用。