[發(fā)明專利]一種大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011472139.8
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112616659B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周艷威;陳紅;張凡;陸小清;李云龍;王傳永;李乃偉;蔡小龍;種昕冉;周婷
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天;邢少華

1.一種大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）采集大別山冬青自然授粉半同胞家系的果實，取發(fā)育至早期子葉胚階段的大別山冬青核果，經(jīng)表面滅菌后，分離出未成熟合子胚；

2）在無菌條件下，將未成熟合子胚接種至誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得胚性愈傷組織；誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+2,4-D 1.0~3mg/L+6-BA 0.2~0.8mg/L+LH0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖30 mg/L+水晶洋菜3g/L；

3）在無菌條件下，將步驟2）獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入維持和增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行維持和增殖；維持和增殖培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+2,4-D 1.5~3.0mg/L+6-BA 0.1~0.5mg/L+LH 0.45g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10mg/L+蔗糖20~30mg/L+水晶洋菜3g/L；

4）在無菌條件下，將步驟3）獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中至子葉胚成熟后，將成熟的子葉胚轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基中直至萌發(fā)長成完整的再生植株；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+2,4-D 0.5~1.0mg/L+KT 1.0~2.0 mg/L+CH 0.5g/L+Glu 0.5g/L+Vc 10 mg/L+蔗糖40mg/L+水晶洋菜3g/L；

5）再生植株的煉苗和移栽；

所述改良MS培養(yǎng)基是以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其它成分不變的條件下調(diào)整以下組分的含量為：NH₄NO₃ 800mg/L，KNO₃ 700mg/L，(NH₄)₂SO₄ 400mg/L， CaCl₂·2H₂O 96mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 555.96mg/L，ZnSO₄·4H₂O 6.9mg/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟1）中，在采集大別山冬青自然授粉半同胞家系的果實，分離出未成熟合子胚時，按照如下步驟進(jìn)行：采集大別山冬青全紅果實，置于4℃條件下冷藏保存，然后揉搓去掉果皮和果肉，并在流水下沖洗得到干凈的核果；取發(fā)育至早期子葉胚階段的大別山冬青核果，經(jīng)過75%乙醇和2%次氯酸鈉溶液表面滅菌后，在無菌條件下取出合子胚。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟2）中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：黑暗條件，控溫23℃，培養(yǎng)25-28天。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟3）中，維持和增殖培養(yǎng)的條件為：黑暗條件，控溫23℃，每隔20天繼代一次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟4）中，體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：黑暗條件，控溫23℃，培養(yǎng)20~30天。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟4）中，將成熟的子葉胚轉(zhuǎn)移到MS基本培養(yǎng)基中，光照3000lx，光照/黑暗的時間為16h/8h，控溫23~25℃，直至萌發(fā)長成完整的植株。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，步驟5）中，在再生植株的煉苗和移栽時，按照如下步驟進(jìn)行：在再生植株長到4-6片真葉，高度為5-6cm后，選擇根系發(fā)達(dá)、生長健壯的再生苗，開瓶馴化，在人工培養(yǎng)室內(nèi)放置3~5天；然后取出并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至消毒過的珍珠巖∶泥炭土（V:V）=1∶2~4的混合基質(zhì)中。