[發明專利]一種牙周炎致病菌的分離方法

有效

• 申請號: 202011471632.8
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112574886B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 高社干;谷變利;李鐘杰;鄭月月;孔金玉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12Q1/24;C12R1/01
• 代理公司: 河南省古格知識產權代理事務所(普通合伙) 41197
• 代理人: 陳娟

本發明涉及微生物培養技術領域，公開了一種牙周炎致病菌的分離方法，包括以下步驟：細菌的采樣：采用無菌牙線棒從人體的牙縫進行取樣，制得原始樣本懸液；分離培養基的配制：按比例將混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、碳酸氫鈉、L?半胱氨酸鹽、可溶性焦磷酸鈉混合，加水定容至1L，滅菌降溫后，按比例加入血紅素、維生素K和無菌脫纖維綿羊血，倒平板，冷卻，獲得分離培養基；細菌的培養：從厭氧培養箱中取出所述原始樣本懸液，37℃厭氧條件下經過所述分離培養基的培養產生特征性單克隆。本發明提供的取樣方法簡單、快捷，不會加劇牙齦出血和感染風險，并且提供的分離培養基的特異性高，縮短原代分離牙周炎致病菌的培養周期。

技術領域

本發明涉及一種微生物培養技術領域，尤其涉及一種牙周炎致病菌的分離方法。

背景技術

牙周病是一種慢性感染性疾病，牙周組織損傷與多種口腔微生物有關。其中牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是口腔常見疾病的主要致病菌之一，也是公認的牙周疾病最重要的可疑致病菌之一；普雷沃氏菌屬(Prevotella spp)是引起牙周疾病的病原菌之一，主要寄生在人類口腔中，是嚴格厭氧革蘭氏陰性菌。流行病學研究表明，在牙周病患者及牙周健康者的牙周袋、齦溝、舌面、牙齦部位均可檢測到多種致病菌。

目前，牙齦卟啉單胞菌等厭氧菌相關的研究，多圍繞少數幾種已建立的國際標準菌株開展，如ATCC 33277、W50、ATCC 53977、W83等。然而，由于牙齦卟啉單胞菌本身的遺傳多樣性，標準菌株的致病性、產生的臨床癥狀等，其代表性都十分有限，如ATCC 53977、W83感染引起的機體免疫反應，與ATCC 33277相比，具有顯著不同。利用測序技術進行的研究表明，即使是同一個牙周炎患者，其口腔中的牙齦卟啉單胞菌也具有明顯的遺傳多樣性，這些差異可能是導致牙齦卟啉單胞菌各菌株致病能力及機制不同的原因。因此，對中國人群口腔牙齦卟啉單胞菌臨床菌株分離對于進一步研究其生物學特性及致病機理意義重大。國內外有關人類普雷沃氏菌屬的研究較少，最近的研究多集中在宏基因組學測定分布變化以及普雷沃氏菌屬與牙齦卟啉單胞菌在疾病發生中的協同作用等方面。

體外培養是研究普雷沃氏菌屬與牙齦卟啉單胞菌等厭氧細菌致病性及致病機理的重要手段。目前，國內外研究中，一般采用紙尖吸附法、齦下刮治器收集法采集齦溝液，進行培養；標準菌株常采用牛腦心浸出液(Brain Heart Infusion，BHI)或胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth，TSB)瓊脂培養基添加脫纖維綿羊血；接種步驟常采用梯度稀釋結合涂布法，對原始獲取樣本懸液進行連續稀釋，使用三角涂棒均勻涂布于瓊脂平板上，37℃專性厭氧條件(5％H2、10％CO2、85％N2)下培養5～7乃至14天不等。待長出特征性菌落，挑取可能的目標菌株，鑒定為陽性目標菌后，進行反復劃線傳代直至獲得純菌株。整個分離篩選純化周期，往往需要2～3個月時間，甚至更長。

上述分離培養方法，其中樣本采集存在以下問題：1)樣本采集需要借助特定的設備；(2)基本針對牙周炎患者，無法實現對沒有牙周袋或牙周袋不明顯的健康個體取樣；(3)操作有創，易造成受試者的痛苦和不適；(4)可能加劇牙齦出血，從而加劇感染。常用的兩種培養基在原代分離普雷沃氏菌屬與牙齦卟啉單胞菌等厭氧細菌時，存在的問題有：營養豐富，在分離苛養細菌時缺乏針對性，非目標雜菌容易生長過盛，影響目標菌的分離。涂布法進行的梯度稀釋，操作繁瑣，對嚴格厭氧細菌的分離效果較差，不利于單個目標菌菌落的形成，延長分離篩選周期。

發明內容

本發明的目的在于提供一種牙周炎致病菌的分離方法，以解決現有技術中取樣受樣本狀態限制、取樣繁瑣以及培養基特異性差等問題。

本發明的目的采用如下技術方案實現：一種牙周炎致病菌的分離方法，包括以下步驟：

細菌的采樣：取出無菌牙線棒，將牙線嵌入人體的牙縫間，在牙齦處往返拉動至少兩次，取出牙線，將牙線的纖維線浸入至已經過厭氧預平衡處理的TSB液體培養基中，無菌槍頭吹打數次，制成原始樣本懸液，放入厭氧培養箱中待用；