[發明專利]一種牙周炎致病菌的分離方法

有效

• 申請號: 202011471632.8
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112574886B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 高社干;谷變利;李鐘杰;鄭月月;孔金玉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/20;C12Q1/24;C12R1/01
• 代理公司: 河南省古格知識產權代理事務所(普通合伙) 41197
• 代理人: 陳娟

1.一種牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

細菌的采樣：取出無菌牙線棒，將牙線嵌入人體的牙縫間，在牙齦處往返拉動至少兩次，取出牙線，將牙線的纖維線浸入至已經過厭氧預平衡處理的TSB液體培養基中，無菌槍頭吹打數次，制成原始樣本懸液，放入厭氧培養箱中待用；

分離培養基的配制：按重量組分計，將10～20份混合蛋白胨、5～10份酵母浸出粉、1～5份氯化鈉、10～15份瓊脂、0.5～1.0份葡萄糖、0.2～0.8份碳酸氫鈉、0.1～0.5份L-半胱氨酸鹽、0.1～0.5份可溶性焦磷酸鈉混合，加水定容至1L，高壓鍋滅菌后，在高壓鍋內將溫度降至65～75℃時，取出放于60℃水浴鍋中緩慢降溫；然后加入0.0001～0.0005份血紅素、0.00001～0.00005份維生素K和5～10份無菌脫纖維綿羊血，混勻，獲得液體的分離培養基；將液體的分離培養基倒平板，冷卻，獲得固體的分離培養基；

細菌的培養：從厭氧培養箱中取出所述原始樣本懸液，37℃厭氧條件下經過所述分離培養基的培養產生特征性單克隆。

2.根據權利要求1所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，在進行所述細菌的培養之前還需要進行分離培養基的厭氧預平衡處理，具體步驟包括：

將所述分離培養基放入37℃厭氧培養箱中保持24h。

3.根據權利要求2所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，所述細菌的培養包括：

細菌的初代培養：從厭氧培養箱中取出所述原始樣本懸液，無菌接種環沾取適量樣本，采用分區連續劃線法，劃至已經過厭氧預平衡處理的所述分離培養基上，37℃厭氧條件下培養7～10天；

PCR檢測：用無菌槍頭挑取黑色圓形凸起的單克隆至10～20μL TSB液體培養基中，混勻菌液后，取2～4μL進行直接PCR檢測；

細菌的傳代培養：經PCR檢測為陽性后，將剩余菌液用無菌接種環分區連續劃線至已經過厭氧預平衡處理的所述分離培養基上，繼續37℃厭氧條件下培養7～10天；

其中，依次重復所述PCR檢測步驟和所述細菌的傳代培養步驟至少一次，至所述分離培養基上形成單一的墨黑色圓形特征克隆。

4.根據權利要求3所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，所述牙周炎致病菌的分離方法還包括細菌的鑒定，具體步驟如下：

挑取墨黑色圓形特征單克隆至10～20μL TSB液體培養基中，混勻菌液后，進行直接PCR檢測或者革蘭氏染色鑒定或者16S rDNA基因測序鑒定中的任意一種或者任意兩種或者全部。

5.根據權利要求4所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，所述細菌的培養中的PCR檢測和所述細菌的鑒定中的PCR檢測中所用的引物包括第一上游引物和第一下游引物；

所述第一上游引物的序列為：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；

所述第一下游引物的序列為：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

6.根據權利要求5所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，所述細菌的培養中的PCR檢測和所述細菌的鑒定中的PCR檢測中的PCR擴增反應體系為：

PCR擴增反應程序為：

95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36個循環；72℃，10min。

7.根據權利要求2所述的牙周炎致病菌的分離方法，其特征在于，所述細菌的培養包括：

菌液的稀釋：取兩份5μL的原始樣本懸液，分別以原始樣本懸液與TSB液體培養基體積比為1:100和1：10000的比例將TSB液體培養基加入原始樣本懸液中對原始樣本懸液進行稀釋，獲得第一稀釋菌液和第二稀釋菌液；

細菌的初代培養：分別取100μL第一稀釋菌液和100μL第二稀釋菌液，采用涂布法接種于已經過厭氧預平衡處理的所述分離培養基上，37℃厭氧培養7～10天，至培養出黑色圓形凸起的單克隆。