[發明專利]一種檢測轉基因植物中目的基因表達的通用引物及檢測方法

在審

• 申請號: 202011470910.8
• 申請日: 2018-06-20
• 公開（公告）號: CN112592995A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 王喜慶;劉芳;莊軍紅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏

1.一種通用的對含有不同外源目的基因的多種轉基因材料進行高通量檢測的方法，為檢測所述轉基因植物的cDNA中是否含有序列1第1-93位所示的DNA片段，若含有，則該轉基因植物表達或候選表達目的基因；若不含有，則該轉基因植物不表達或候選不表達目的基因；

所述檢測所述轉基因植物的cDNA中是否含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段的方法為以所述轉基因植物的cDNA為模板，用引物對進行熒光定量PCR擴增，得到待測轉基因植物PCR擴增產物；檢測所述待測轉基因植物PCR擴增產物，若有S曲線或S擴增曲線或2^-ΔCt值大于0，則該轉基因植物的cDNA中含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段；若無S擴增曲線或2^-ΔCt值小于等于0，則該轉基因植物不含序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段；

所述引物對由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成；

所述轉基因植物為將所述外源目的基因導入野生型植物中得到的植物，且所述外源目的基因的終止子為NOS終止子或至少含有序列1所示核苷酸的NOS終止子部分序列。

2.一種檢測轉基因植物中導入的外源目的基因是否表達并排除植物本身同一基因表達的方法，為檢測所述轉基因植物的cDNA中是否含有序列1第1-93位所示的DNA片段，若含有，則該轉基因植物表達或候選表達目的基因；若不含有，則該轉基因植物不表達或候選不表達目的基因所述檢測所述轉基因植物的cDNA中是否含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段的方法為以所述轉基因植物的cDNA為模板，用引物對進行熒光定量PCR擴增，得到待測轉基因植物PCR擴增產物；檢測所述待測轉基因植物PCR擴增產物，若有S曲線或S擴增曲線或2^-ΔCt值大于0，則該轉基因植物的cDNA中含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段；若無S擴增曲線或2^-ΔCt值小于等于0，則該轉基因植物不含序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段；

所述引物對由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成

所述轉基因植物為將所述外源目的基因導入野生型植物中得到的植物，且所述外源目的基因的終止子為NOS終止子或至少含有序列1所示核苷酸的NOS終止子部分序列。

3.一種檢測轉基因植物中導入的外源目的基因的表達量的方法，其中所述外源目的基因的終止子是NOS終止子，該方法包括如下步驟：

1)提取待測轉基因植物的RNA，再反轉錄得到cDNA；

2)以所述cDNA為模板，用針對NOS終止子的引物對進行熒光定量PCR擴增，得到待測轉基因植物PCR擴增產物；

檢測待測轉基因植物PCR擴增產物和野生型植物PCR擴增產物，采用2^-ΔCT方法計算待測轉基因植物中外源目的基因的相對表達量；

待測轉基因植物中外源目的基因的相對表達量＝2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_{(目的基因，樣品)}-Ct_{(內參基因，樣品)})；

其中NOS終止子含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段序列；

其中所述針對NOS終止子的引物對由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成。

4.一種篩選導入外源目的基因表達量高的轉基因植物植株的方法，其中所述外源目的基因的終止子是NOS終止子，該方法包括如下步驟：

1)提取待測轉基因植物的RNA，再反轉錄得到cDNA；

2)以所述cDNA為模板，用針對NOS終止子的引物對進行熒光定量PCR擴增，得到待測轉基因植物PCR擴增產物；

檢測待測轉基因植物PCR擴增產物和野生型植物PCR擴增產物，采用2^-ΔCT方法計算待測轉基因植物中外源目的基因的相對表達量；

待測轉基因植物中外源目的基因的相對表達量＝2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_{(目的基因，樣品)}-Ct_{(內參基因，樣品)})；

從中選取表達量最高的單株培育，得到導入外源目的基因表達量高的轉基因植物植株；其中NOS終止子含有序列1或序列1第1-93位所示的DNA片段序列；

其中所述針對NOS終止子的引物對由序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的單鏈DNA分子組成。