[發明專利]一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法

在審

• 申請號: 202011469077.5
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112569371A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 沈玉幫;郭加民;李家樂;徐曉雁;蘇玉紅
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A01K61/10;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

本發明公開了一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，屬于水產動物種質資源鑒定技術領域。選用一齡或二齡體長10?12cm的健康無畸形草魚暫養5?7天，將嗜水氣單胞菌接種于高壓蒸汽滅菌后的NB肉湯培養基中，于28℃恒溫培養箱中搖床培養16?18h，用PBS將菌液母液分別稀釋至10¹⁰、10⁸和10⁶cfu/mL數量級，對暫養后的草魚分組注射稀釋菌液進行人工感染，從存活程度和表現癥狀判斷草魚對細菌性敗血癥的抗性。本發明的鑒定方法可在室內進行，受時間、空間和環境影響較小，且鑒定周期短，速度快，單人即可完成操作，節省人力物力，結果準確可靠。

技術領域

本發明屬于水產動物種質資源鑒定技術領域，具體涉及一種人工感染鑒 定草魚細菌性敗血癥抗性的方法。

背景技術

草魚(Ctenopharyngodon idella)，中國四大家魚之一，廣泛分布于各大水 系，為中國淡水魚主要養殖對象。但是，隨著養殖數量和規模不斷擴大以及 養殖環境不斷惡化，草魚的種質資源開始逐漸減少，魚病也造成巨大養殖經 濟損失，改善種質有助于養殖業的長期發展。選育草魚抗病品種，并利用其 自身的遺傳因素抗病是根本途徑，其中良種選育的關鍵在于對抗細菌性敗血 癥草魚的鑒定。

現有技術中，通過自然感染即在養殖水中由嗜水氣單胞菌引起的細菌性 敗血癥爆發后，經過自然選擇使抗病的個體存活，從而鑒定篩選出抗病個體。 但該方法耗時長、代價高、受氣候和環境等因素的影響較大，且需要較大的 空間，為防止水體對周圍環境產生影響，在篩選鑒定結束后，還需要對池塘 進行全面消毒，工序繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方 法，通過人工感染不同濃度梯度的嗜水氣單胞菌菌液，觀察死亡和存活個體 和表現癥狀判斷草魚細菌性敗血癥抗性。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，包括以下步驟：

(1)草魚暫養：將一齡或二齡體長10-12cm的健康無畸形草魚置于曝氣 的養殖容器中暫養5-7天，每日早晚投喂兩次，第二次喂食結束后換一半新的 養殖水，人工感染前72h停止投喂；

(2)細菌培養：將嗜水氣單胞菌接種于高壓蒸汽滅菌后的NB肉湯培養 基中，于28℃恒溫培養箱中搖床培養16-18h，存放于4℃冰箱備用；

(3)菌液稀釋：將步驟(2)中培養的菌液恢復至室溫，用PBS將菌液 母液分別稀釋至10¹⁰cfu/mL、10⁸cfu/mL和10⁶cfu/mL數量級；

(4)人工感染：對步驟(1)中暫養后的草魚分組注射步驟(3)中稀釋 菌液進行人工感染，采用相同的方法注射PBS作為對照；

(5)癥狀觀察和抗性評定：每天觀察步驟(4)中人工感染后的草魚， 及時清除死亡個體，從存活程度和表現癥狀判斷草魚對細菌性敗血癥的抗性。

根據本發明的一些實施例，步驟(1)中，所述養殖容器為清潔消毒處理 過的50L塑料桶，放入30條草魚和30L曝氣養殖水，同時桶內放置有氣石和 控溫裝置。

根據本發明的一些實施例，步驟(2)中，所述細菌培養的步驟為：用接 種環挑取血平板上長勢好且有明顯溶血圈的單個嗜水氣單胞菌菌落，將接種 環深入到所述NB肉湯培養基中攪拌完成接種，于28℃恒溫培養箱中搖床培 養16-18h，存放于4℃冰箱備用。

根據本發明的一些實施例，步驟(3)中，所述菌液稀釋采用逐級稀釋法， 具體為：取1.5mL試管加入900μL無菌PBS和100μL菌液，此為稀釋10倍， 再從該試管中吸取100μL溶液加入到另一個裝有900μLPBS的試管中，此為 稀釋10²倍，同理繼續向下稀釋。