[發明專利]一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法

在審

• 申請號: 202011469077.5
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112569371A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 沈玉幫;郭加民;李家樂;徐曉雁;蘇玉紅
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A01K61/10;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

1.一種人工感染鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)草魚暫養：將一齡或二齡體長10-12cm的健康無畸形草魚置于曝氣的養殖容器中暫養5-7天，每日早晚投喂兩次，第二次喂食結束后換一半新的養殖水，人工感染前72h停止投喂；

(2)細菌培養：將嗜水氣單胞菌接種于高壓蒸汽滅菌后的NB肉湯培養基中，于28℃恒溫培養箱中搖床培養16-18h，存放于4℃冰箱備用；

(3)菌液稀釋：將步驟(2)中培養的菌液恢復至室溫，用PBS將菌液母液分別稀釋至10¹⁰cfu/mL、10⁸cfu/mL和10⁶cfu/mL數量級；

(4)人工感染：對步驟(1)中暫養后的草魚分組注射步驟(3)中稀釋菌液進行人工感染，采用相同的方法注射PBS作為對照；

(5)癥狀觀察和抗性評定：每天觀察步驟(4)中人工感染后的草魚，及時清除死亡個體，從存活程度和表現癥狀判斷草魚對細菌性敗血癥的抗性。

2.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述養殖容器為清潔消毒處理過的50L塑料桶，放入30條草魚和30L曝氣養殖水，同時桶內放置有氣石和控溫裝置。

3.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述細菌培養的步驟為：用接種環挑取血平板上長勢好且有明顯溶血圈的單個嗜水氣單胞菌菌落，將接種環深入到所述NB肉湯培養基中攪拌完成接種，于28℃恒溫培養箱中搖床培養16-18h，存放于4℃冰箱備用。

4.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述菌液稀釋采用逐級稀釋法，具體為：取1.5mL試管加入900μL無菌PBS和100μL菌液，此為稀釋10倍，再從該試管中吸取100μL溶液加入到另一個裝有900μLPBS的試管中，此為稀釋10²倍，同理繼續向下稀釋。

5.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(4)中，采用胸鰭基部注射，針頭插入深度為1-1.2cm，注射量為0.1mL/條草魚。

6.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述抗性評定的標準為：若在10⁶cfu/mL注射組中存在死亡個體，則存活的個體為抗細菌性敗血癥差的個體；若在10⁸cfu/mL注射組中存在死亡個體，則存活個體為抗細菌性敗血癥中等的個體；若在10¹⁰cfu/mL注射組中存在死亡個體，則存活個體為抗細菌性敗血癥強的個體。

7.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述死亡個體的表現癥狀包括：早期患病外部可見上下頜、眼睛、鰭條及腹腔兩側有輕度充血，肛門紅腫，隨著病情發展上述體表出血癥狀加劇，眼眶周圍有充血，腹部腫大，解剖可見腹腔內有黃色透明或紅色渾濁腹水，腸壁、腸系膜周圍充血呈粉紅或淺紅色，腸內充血且無食物，少數腸內有氣泡。

8.根據權利要求1所述鑒定草魚細菌性敗血癥抗性的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述死亡個體無表現癥狀。