[發(fā)明專利]副溶血弧菌和細菌總數(shù)快速同步多重檢測方法及試劑盒

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• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN113049826A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 隋志偉;劉思淵;王梓權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N15/14;G01N15/10;G01N15/00;C12R1/63
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

一種快速同步多重檢測樣品中副溶血弧菌和細菌總數(shù)的方法和檢測試劑盒，使用可以標記全部細菌的紅色熒光探針對細菌總數(shù)進行標記，區(qū)分樣品中的細菌和其它背景顆粒：同時，使用綠色熒光探針通過化學(xué)基團交聯(lián)的副溶血弧菌抗體，區(qū)分樣品中的副溶血弧菌和非副溶血弧菌；通過流式分析儀同時計數(shù)紅色和綠色熒光信號，實現(xiàn)副溶血弧菌和細菌總數(shù)的同步檢測。本方法能夠同時檢測副溶血弧菌和細菌總數(shù)，操作簡單便捷，耗時短，大多數(shù)樣品均可在0.5h內(nèi)完成檢測。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于食品微生物檢測領(lǐng)域，特別涉及在食品樣品中副溶血弧菌和細菌總數(shù)兩項指標的快速同步多重檢測及試劑盒。

背景技術(shù)：

副溶血弧菌和細菌總數(shù)都是食品微生物檢驗中最基本、最常見的檢測項目。菌落總數(shù)通常指細菌總數(shù)，用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，其在一定程度上標志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。副溶血弧菌是一種海洋細菌，能引起人的急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對副溶血弧菌的測量方法費時費力，如國標GB 4789.7-2013《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》，該方法需要增菌，培養(yǎng)，生化鑒定等一系列步驟，花費時間在60小時以上。

細菌總數(shù)的平板計數(shù)法也有很多缺點，如國標GB 4789.2-2016《菌落總數(shù)測定》，該方法需要采樣，稀釋，傾注平板，培養(yǎng)等一系列步驟，花費時間48小時。

這兩個方法都需要大量人工操作，費時費力，且副溶血弧菌和細菌總數(shù)兩項指標的檢測還必須分別進行。

盡管目前有許多新的技術(shù)被用于副溶血弧菌或細菌總數(shù)的快速檢測，但是這些技術(shù)難以用于同副溶血弧菌和細菌總數(shù)的多重檢測。比如現(xiàn)有生物芯片法無法識別全部種類的細菌；PCR方法僅能實現(xiàn)不同種類細菌的多重檢測，無法實現(xiàn)細菌總數(shù)的檢測。

流式分析技術(shù)有實現(xiàn)副溶血弧菌和細菌總數(shù)指標的多重檢測的潛力，但是由于副溶血弧菌特異性熒光探針的開發(fā)存在許多技術(shù)困難，目前尚未有相關(guān)報道。

綜上所述，快速檢測，同步多重檢測，且能同時檢測副溶血弧菌和細菌總數(shù)，是食品微生物檢驗領(lǐng)域的實際需要，也是技術(shù)難點。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一目的是提供一種副溶血弧菌和細菌總數(shù)的快速同步多重檢測方法，尤其是要滿足以下要求：1、必須能夠區(qū)分細菌和雜質(zhì)；2、能夠定量測量細菌總數(shù)；3、可以從總細菌中特異性識別并定量副溶血弧菌；4、快速同步得到檢測結(jié)果。

本發(fā)明的第二目的是提供能達到上述目的的檢測試劑盒。

本方法具有兩個技術(shù)關(guān)鍵點：一是如何準確區(qū)分細菌和非細菌的顆粒；二是如何特異地識別副溶血弧菌。

針對上述問題，本發(fā)明人進行了如下工作：

1、開發(fā)能識別總細菌的熒光探針

由于細菌種類繁多，選用大腸桿菌、副溶血弧菌作為革蘭氏陰性菌的代表菌株，用金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的代表菌株，用枯草芽孢桿菌作為芽孢形態(tài)細菌的代表菌株。擬通過對四個代表性菌株的研究，并對能夠識別總細菌的熒光探針進行了開發(fā)和優(yōu)化。

2、制備出適合的副溶血弧菌的特異性抗體

采用了偶聯(lián)有綠色熒光探針的副溶血弧菌的抗體，對副溶血弧菌進行特異性熒光標記，并使用流式分析儀對副溶血弧菌的熒光進行分析。

適用于流式分析儀的副溶血弧菌抗體的篩選十分困難：

第一，副溶血弧菌的O抗原分型較多，包括是O1到O13等。其中，副溶血弧菌所有血清型都曾在食物，動物和人類樣品中分離得到。因此，適用的副溶血弧菌抗體需能夠特異性識別上述13個血清型的所有菌株。然而目前，尚未有人制備得到能夠識別所有副溶血弧菌O抗原的抗體。