[發(fā)明專利]副溶血弧菌和細菌總數(shù)快速同步多重檢測方法及試劑盒

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• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN113049826A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 隋志偉;劉思淵;王梓權
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N15/14;G01N15/10;G01N15/00;C12R1/63
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.一種快速同步多重檢測樣品中副溶血弧菌和細菌總數(shù)的方法，其特征如下：

1)區(qū)分樣品中的細菌和其它背景顆粒：使用可以標記全部細菌的紅色熒光探針對細菌總數(shù)進行標記；

2)區(qū)分樣品中的副溶血弧菌和非副溶血弧菌：使用綠色熒光探針通過化學基團交聯(lián)的副溶血弧菌抗體，特異性標記樣品中的副溶血弧菌；

3)通過流式分析儀同時計數(shù)1)和2)產(chǎn)生的紅色和綠色熒光信號，實現(xiàn)副溶血弧菌和細菌總數(shù)的同步定量檢測。

上述2)中，所述副溶血弧菌抗體是用免疫原為4個副溶血弧菌特異性外膜蛋白的混合物制備的，所述4個外膜蛋白分別為OmpU，OmpK，OmpC及OmpA；

上述3)中，副溶血弧菌和細菌總數(shù)的判定方法如下：對于一個顆粒產(chǎn)生的事件，如果僅檢測到紅色熒光，則判定為細菌，但不是副溶血弧菌；如果同時檢測到紅色和綠色兩種熒光，則判定為副溶血弧菌；如果未檢測到熒光，則判定為非細菌的雜質顆粒。

2.權利要求1所述的方法，所述副溶血弧菌抗體還具有以下技術指標：

a所述抗體可以在流動相內(nèi)與副溶血弧菌發(fā)生反應；

b所述抗體經(jīng)過綠色熒光探針交聯(lián)后，能夠對副溶血弧菌進行熒光標記，且熒光可以被熒光顯微鏡和流式分析儀觀察到；

c所述抗體與副溶血弧菌特異性菌體蛋白的親和力KD應小于2×10^-10；

d所述抗體能夠識別所有的副溶血弧菌菌株。

3.權利要求1所述的方法，所述通過流式分析儀計數(shù)，是通過流式分析儀的散射光通道進行圈門，并通過雙熒光通道檢測所述紅色和綠色熒光信號，從而計數(shù)副溶血弧菌和細菌總數(shù)；其中，前向角散射光通道的圈門在500nm到2500nm之間。

4.權利要求3所述的方法，所述圈門，其方法為：使用流式分析儀測量500nm標準微球和2500nm標準微球，在前向角散射光通道的直方圖上，根據(jù)微球的信號位置進行圈門，下限在500nm，上限在2500nm。

5.權利要求1所述的方法，所述紅色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在601nm～640nm；所述綠色熒光探針的熒光發(fā)射光譜在501nm～540nm。

6.權利要求1所述的方法，所述流式分析儀的技術指標和檢測參數(shù)是：熒光靈敏度10MESF，散射光靈敏度50nm，熒光分辨率RSD3％，散射光分辨率3％；分析速度為1～30μL/min，檢測時間為15～300s。

7.權利要求1～6任一所述的方法，待檢樣品進行檢測之前需要進行純化處理；所述純化，方法是將待測樣品加入水中懸液，然后過濾收集濾液，將濾液離心并棄去上層液體，保留底部的沉淀，然后加入PBS重懸，得到純化的樣品菌懸液。

8.一種用于同步多重檢測樣品中副溶血弧菌和細菌總數(shù)的副溶血弧菌抗體，是用免疫原為4個副溶血弧菌特異性外膜蛋白的混合物制備的，所述4個外膜蛋白分別為OmpU，OmpK，OmpC及OmpA；

所述副溶血弧菌抗體還具有以下技術指標：

a所述抗體可以在流動相內(nèi)與副溶血弧菌發(fā)生反應；

b所述抗體經(jīng)過綠色熒光探針交聯(lián)后，能夠對副溶血弧菌進行熒光標記，且熒光可以被熒光顯微鏡和流式分析儀觀察到；

c所述抗體與副溶血弧菌特異性菌體蛋白的親和力KD應小于2×10^-10；

d所述抗體能夠識別所有的副溶血弧菌菌株。