[發明專利]基于斑馬魚幼魚成像模型評價緩解食源性腸炎成分的方法

有效

• 申請號: 202011464150.X
• 申請日: 2020-12-17
• 公開（公告）號: CN112997926B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 夏曉勤;吳南;黎明;程瑩寅
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: A01K61/10
• 分類號: A01K61/10;A23K50/80;A23K10/30;A23K10/22;A23K10/37;G01N21/64;G01N21/84
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了一種基于斑馬魚幼魚成像模型評價緩解食源性腸炎成分的方法。該方法基于先天免疫細胞雙標記品系及后天免疫細胞單標記品系Tg轉基因熒光標記斑馬魚構建食源性腸炎模型，通過投喂飼料的方式分別在先天/后天免疫細胞起作用的時間階段，采用熒光成像的可視化的方式，有效呈現出各類免疫細胞參與食源性腸炎過程的行為，用以評價緩解魚類食源性腸炎的成分。該方法有效地縮短了評價周期，較為完整地展現緩解食源性腸炎成分對先天免疫和后天免疫的影響，同時克服了傳統成魚模型試驗周期長和操作復雜的弱點，也避免了短期浸泡幼魚會引起全身黏膜組織免疫反應的問題。

技術領域

本發明屬于魚類營養免疫學領域，具體涉及一種基于斑馬魚幼魚免疫細胞成像的方式建立食源性腸炎模型的方法，以及運用此模型評價或篩選能夠緩解魚類食源性腸炎成分的方法。

背景技術

食源性腸炎是水產生產應用上引起魚類疾病和生長抑制的重要限制性因素，日漸引起學術界的重視，國內外相關魚類營養學、免疫學、腸道微生物學的研究都已在模式動物斑馬魚上大量進行，50％豆粕替代蛋白源的飼料已被作為斑馬魚腸炎建模的常用配方。而作為更加快捷的方式，斑馬魚幼魚的腸炎建模也有多個團隊在探索。斑馬魚幼魚腸道在5-8dpf階段完成腸道菌群定植，此后幼魚腸道功能才開始逐漸健全。在斑馬魚幼魚腸黏膜中，先天免疫細胞在一周內就能觀察到信號，而后天免疫的細胞需要在出膜3周以后才能觀察到信號，到接近一月齡時斑馬魚幼魚才和成魚的腸道免疫細胞組成類似。

目前，斑馬魚幼魚腸炎建模主要有2種方式，浸泡或者投喂飼料，所用到品系多為免疫細胞熒光標記品系，例如標記先天免疫細胞(中性粒細胞、巨噬細胞)，標記后天免疫的T淋巴細胞的品系。在斑馬魚腸炎模型中，目前有報道熒光標記中性粒細胞用到的品系有多種，例如Tg(BACmpo:GFP、Tg(mpxI:Dendra2)；而標記巨噬細胞為mpeg基因的熒光標記，有見到和中性粒細胞品系雜交的雙熒光標記品系Tg(mpeg1:mCherry/mpx:eGFP)；標記后天免疫細胞的僅見到標記T淋巴細胞的品系，為Tg(lck:EFP)。

腸黏膜中的T淋巴細胞對于腸道健康起到非常重要作用。豆粕誘導的斑馬魚腸炎已被揭示是Th17型細胞因子主導的炎癥類型，T細胞在腸道發生炎癥時增多并且發生快速的細胞遷移，Th17反應相關細胞因子上調表達，而作為平衡的另一端調節性T細胞的轉錄因子和效應因子均表現為下調表達。以上結果反過來提示調節性T細胞的抑制炎癥的作用應該作為腸炎藥物開發的重點。本研究團隊已建立了斑馬魚成魚的食源性腸炎模型，并且已將其應用于評價飼料添加成分緩解腸炎的作用，例如已發表的加蘭他敏，是經由膽堿能通路激活調節性淋巴細胞起到抗腸炎作用。但是在魚類的腸黏膜免疫中除了調節性T淋巴細胞，B淋巴細胞也積極參與抗感染，其分泌的天然免疫球蛋白IgM等效應因子，對于食源性腸炎的炎癥發生和恢復都起到重要作用。Rag2作為T/B淋巴細胞發育不可或缺的重要因子，其熒光標記斑馬魚品系可指示腸道后天免疫細胞，但是目前還沒有被用作腸炎機理的研究及相關藥物研發。與此同時，lck作為T淋巴細胞成熟的標志，其熒光標記的品系僅被少見用來研究斑馬魚腸道先天免疫階段，缺乏在后天免疫階段細胞水平和運用于腸炎模型評價緩解成分的研究。

目前，用斑馬魚幼魚成像來進行腸炎研究，還存在的問題表現在：(1)短期浸泡引起的全身黏膜反應可能會削弱腸道免疫細胞的響應，并且作為半衰期很短的中心粒細胞的表現在不同魚體的差異較大，另一方面巨噬細胞的吞噬作用(phagocyte)對于魚類腸道健康的維持非常重要，而浸泡引起的巨噬細胞的反應主要在因吞咽而起作用的前腸，而非腸粘膜主要的反應部位—中后腸；(2)飼料投喂時間段的選擇對于腸道正常發育和免疫反應的呈現具有重要的決定性作用，但是現有的報道多為從5dpf到7dpf的開口飼料投喂，這階段僅能引起腸道先天免疫細胞的反應，而到3周到4周這個腸道發育至后天免疫細胞駐留階段的研究還非常有限，僅有的T細胞參與豆粕引起腸炎的個別報道還是基于9dpf之前。