[發明專利]一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用

有效

• 申請號: 202011462595.4
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112457382B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 張瑜;孫金苗;李迅;王飛;楊冰燕;董亦馨
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/22;C12N15/29;C12N15/70;A61K38/16;A61K47/69;A61P3/02
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 李建芳

本發明公開了一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用。紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，包括重組表達質粒、重組蛋白的表達和蛋白的純化；重組表達質粒時，所用質粒為pET?20b(+)，將紫花苜蓿植物鐵蛋白基因序列克隆至pET?20b(+)質粒的NdeI和XhoI酶切位點之間，得含目的基因的重組質粒。本發明紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，得到的紫花苜蓿植物鐵蛋白呈球形籠狀結構，分子量約為28kDa，直徑約為12±0.5nm，水溶性好、熱力學穩定性高，分散均一。作為一種新型的植物鐵蛋白，為生物活性物水溶性、穩定性和生物利用度等的提高，提供了一種新型納米載體，在食品、醫療、保健等方面有良好的應用前景，具有很高的應用價值。

技術領域

本發明涉及一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用，屬于植物鐵蛋白技術領域。

背景技術

鐵蛋白在生物體內具有維持體內鐵的代謝平衡、清除鐵介導的自由基反應、以及保護細胞免受氧化性損傷的作用。鐵蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物中，每個鐵蛋白內部最多可儲存約4500個鐵原子。鐵蛋白通常由24個亞基自組裝形成高度對稱的籠狀結構，內徑和外徑分別為8nm和12nm，厚度約為2nm。每分子的鐵蛋白可以形成12個二重軸通道，8個三重軸通道，4個六重軸通道，這些通道控制著離子或小分子進出鐵蛋白，聯系內部空腔與外部環境。

動物鐵蛋白納米載體在癌癥治療、免疫檢測、醫學成像領域已取得了突破性進展。然而，目前對植物鐵蛋白的研究尚未深入，植物鐵蛋白分布廣泛，主要存在質體中，與動物鐵蛋白具有相同的起源，但植物鐵蛋白的24個亞基均為H型，每個亞基都含有一個亞鐵氧化中心，其中的H-1和H-2型亞基具有80％的氨基酸序列同源性。成熟植物鐵蛋白的 N端有一段由約30個氨基酸組成的延伸肽，參與鐵的氧化沉淀，誘導蛋白質的聚合，提高蛋白質的穩定性。若能將植物鐵蛋白表達純化，則具有廣闊的應用前景，然而由于不同植物鐵蛋白個體性能上的差異，導致表達純化的條件上存在根本性差異。

發明內容

本發明提供一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，紫花苜蓿植物鐵蛋白呈球形籠狀結構，水溶性好，熱穩定好，是一種可用于生物活性物質及藥物遞送的新型納米載體。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，包括重組表達質粒、重組蛋白的表達和蛋白的純化；重組表達質粒時，所用質粒為pET-20b(+)質粒，將紫花苜蓿植物鐵蛋白基因序列克隆至pET-20b(+)質粒的NdeI和XhoI酶切位點之間，得含目的基因的重組質粒。

紫花苜蓿植物鐵蛋白來源于紫花苜蓿。

紫花苜蓿植物鐵蛋白的編碼基因序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；紫花苜蓿植物鐵蛋白的編碼蛋白為SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

為了提高產品的得率和效率，重組蛋白的表達為，在42±2℃的條件下，將重組質粒熱激轉化至大腸桿菌宿主細胞BL21(DE3)中，從平板上挑取單菌落于TB培養基中擴大培養OD600＝1.8，經IPTG誘導后，離心收集菌體沉淀，再將菌體沉淀用緩沖液重懸、超聲破碎、離心后，得到的上清液即為紫花苜蓿植物鐵蛋白的粗產品，其中，重懸所用緩沖液 pH＝8，組成為：20mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)，500mM NaCl，0.5％Triton X-100(聚乙二醇辛苯基醚)，2mM DTT(二硫蘇糖醇)。

本申請％，沒有特別說明的情況下，指體積百分比。

為了提高產品的得率，擴大培養于含氨芐青霉素的TB培養基中培養，其中，菌液按照1％的比例接種于TB培養基中，擴大培養時的溫度為37±2℃，轉速為210±10r/min。

優選，IPTG的誘導終濃度為1±0.02mM，誘導溫度為25±2℃，轉速為200±10r/min，誘導終時間為16±1h。當誘導溫度更換為30℃，誘導終濃度為5mM時，表達出的蛋白為包涵體，不可溶。