[發明專利]一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法及其應用

有效

• 申請號: 202011462595.4
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112457382B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 張瑜;孫金苗;李迅;王飛;楊冰燕;董亦馨
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/22;C12N15/29;C12N15/70;A61K38/16;A61K47/69;A61P3/02
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 李建芳

1.一種紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，特征在于：包括重組表達質粒、重組蛋白的表達和蛋白的純化；重組表達質粒時，所用質粒為pET-20b（+）質粒，將紫花苜蓿植物鐵蛋白基因序列克隆至pET-20b（+）質粒的NdeI和XhoI酶切位點之間，得含目的基因的重組質粒；

紫花苜蓿植物鐵蛋白的編碼基因序列為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

重組蛋白的表達為，在42±2℃的條件下，將重組質粒熱激轉化至大腸桿菌宿主細胞BL21(DE3)中，從平板上挑取單菌落于TB培養基中擴大培養至OD600=1.8，經IPTG誘導后，離心收集菌體沉淀，再將菌體沉淀用緩沖液重懸、超聲破碎、離心后，得到的上清液即為紫花苜蓿植物鐵蛋白的粗產品，其中，重懸所用緩沖液pH=8，組成為：20mM Tris，500mM NaCl，0.5% Triton X-100和2mM DTT；

蛋白的純化時，采用鎳柱親和層析對目的蛋白進行純化，包括如下步驟：

A、將預裝鎳柱用10±1倍柱體積的無菌水清洗兩次，再用10±1倍柱體積的結合緩沖液平衡鎳柱；

B、將蛋白粗品過0.45μm濾膜后，與Ni-NTA樹脂結合，置于旋轉培養器中，在4±1℃環境中孵育55~65min，使目的蛋白與鎳柱充分結合；

C、用pH=6.3的5±0.1mM咪唑洗除雜蛋白，接著用洗脫液洗脫目的蛋白，再用體積排阻色譜純化，得到純紫花苜蓿重組植物鐵蛋白。

2.如權利要求1所述的紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，特征在于：擴大培養于含氨芐青霉素的TB培養基中培養，其中，菌液按照1%的比例接種于TB培養基中，擴大培養時的溫度為37±2℃，轉速為210±10r/min。

3.如權利要求1或2所述的紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，特征在于：IPTG的誘導終濃度為1±0.02mM，誘導溫度為25±2℃，轉速為200±10r/min，誘導終時間為16±1h。

4.如權利要求1或2所述的紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法，特征在于：超聲破碎的條件為：在功率為960W的條件下，每超5±1s，停5±1s，總時長為30±2min；超聲破碎后的離心條件為：8000×ｇ，離心30min。

5.權利要求1-4任意一項所述的紫花苜蓿植物鐵蛋白的表達純化方法所得紫花苜蓿重組植物蛋白的應用，其特征在于：用于柚皮素的裝載。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于：柚皮素裝載的方法，包括如下步驟：

A、將柚皮素溶于無水乙醇制備成母液；

B、所得的紫花苜蓿重組植物蛋白中添加尿素避光孵育2±0.3h，得蛋白溶液；

C、步驟A的母液加入到步驟B所得的蛋白溶液中，4±1℃條件下避光攪拌30±5min，然后將溶液轉移至透析袋中，透析除去尿素和未結合的柚皮素分子，離心后，得到的澄清透明溶液為紫花苜蓿重組植物蛋白-柚皮素復合物。