[發(fā)明專利]一種中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN112514795A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李威亞;潘美紅;陳微;惠林沖;楊海峰;繆美華;何林玉
• 申請（專利權(quán)）人: 連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 李德濺

本發(fā)明公開了一種中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養(yǎng)方法，該方法步驟如下：5月架設(shè)防蟲隔離網(wǎng)，剪取花球且冰箱預(yù)處理；配制MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基并倒入培養(yǎng)瓶中滅菌處理；摘除未開放花蕾的上萼片及花瓣，切留2～3mm花梗后裹入紗布流動(dòng)凈水沖洗；花蕾消毒后插入MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，組培室培養(yǎng)；繼代移植培養(yǎng)；配制B5再生培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶后進(jìn)行滅菌處理；產(chǎn)生胚狀體后移入B5再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)；流式細(xì)胞儀檢測再生植株倍性，單倍體植株馴化培養(yǎng)后移至大田自然生長。本發(fā)明利用外包萼片及花瓣去除、低溫刺激、花梗營養(yǎng)長度控制、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、激素配比誘導(dǎo)的方法，培養(yǎng)污染率不超過14%，洋蔥誘導(dǎo)出苗率達(dá)到2～5%，可操作性強(qiáng)且重復(fù)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于洋蔥育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種利用洋蔥花蕾培養(yǎng)、誘導(dǎo)洋蔥雌配子體向孢子體途徑轉(zhuǎn)化再生成單倍體植株以加快洋蔥育種進(jìn)程、縮短雜交種育種年限的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

洋蔥（Allium cepa L.，染色體數(shù) 2n=2x=16）目前是世界上栽培面積最大的蔬菜作物之一，在我國栽培面積增長迅速，為農(nóng)民重要出口創(chuàng)收蔬菜。由于我國引進(jìn)洋蔥栽培時(shí)間短，種植資源相對稀少，市場上主栽洋蔥大多為國外進(jìn)口品種，種子價(jià)格十分昂貴。因此實(shí)現(xiàn)品種自主、擺脫進(jìn)口依賴、降低農(nóng)戶種植成本成為目前發(fā)展我國洋蔥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。優(yōu)良的洋蔥常規(guī)及雜交品種要求整齊一致，這主要取決于常規(guī)材料及親本自交系的純合程度。洋蔥異化授粉特點(diǎn)明顯，通常3代自交即開始出現(xiàn)明顯性狀退化問題，品種選育周期達(dá)6～10年。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種利用洋蔥花蕾培養(yǎng)、誘導(dǎo)洋蔥雌配子體向孢子體途徑轉(zhuǎn)化再生成單倍體植株以加快洋蔥育種進(jìn)程、縮短雜交種育種年限的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養(yǎng)方法；該培養(yǎng)方法利用外包萼片及花瓣去除、低溫刺激、激素配比誘導(dǎo)、花梗營養(yǎng)長度控制、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)以降低污染率、提高洋蔥大孢子單倍體培養(yǎng)出苗率，達(dá)到加快洋蔥育種進(jìn)程、縮短雜交種育種年限目的。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養(yǎng)方法，其特征在于：該方法步驟如下：

a、5月份洋蔥抽薹時(shí)架設(shè)防蟲隔離網(wǎng)，選擇已開放個(gè)別花蕾的花球并剪取帶3～5cm花葶的花球，塑料袋包裝后放入冰箱冷藏預(yù)處理；

b、在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2mg/L的2，4-D＋2mg/L的6-BA＋100g/L的蔗糖＋7g/L的瓊脂、用1%NaOH調(diào)其pH值至5.8～6.1配制成MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并將MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶后進(jìn)行滅菌處理；

c、從冰箱取出預(yù)處理的花球，選擇花球中的未開放花蕾，用鑷子摘除未開放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入紗布流動(dòng)凈水沖洗；

d、超凈工作臺(tái)中對沖洗后的花蕾消毒后用濾紙吸干水分，鑷子夾取花蕾插入步驟b滅菌處理后的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)瓶插植13～17個(gè)花蕾，完成后放置在組培室中培養(yǎng)；

e、組培室中培養(yǎng)70～90天，移入新的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代移植培養(yǎng)；

f、在B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30g/L蔗糖＋7g/L瓊脂、用1%NaOH調(diào)其pH值至5.8～6.1配制成B5再生培養(yǎng)基，并將B5再生培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶后進(jìn)行滅菌處理；

g、待繼代移植培養(yǎng)的花蕾產(chǎn)生胚狀體后，將胚狀體移入步驟f滅菌處理后的B5再生培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)瓶插植3～6個(gè)產(chǎn)生胚狀體的花蕾，完成后放置在組培室中培養(yǎng)；

h、胚狀體發(fā)育成再生植株后，取植株葉片并用流式細(xì)胞儀檢測倍性，驗(yàn)證單倍體植株并移至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在玻璃室中馴化培養(yǎng)至單倍體植株正常生長后移栽至室外大田。

所述步驟a中的冰箱冷藏預(yù)處理的冷藏溫度為0～4℃、預(yù)處理時(shí)間為5～7天。

所述步驟b和步驟f中的滅菌處理的過程為：將配制好的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基或B5再生培養(yǎng)基倒入對應(yīng)的帶有透氣孔蓋的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶擰蓋后放入120℃的高壓鍋內(nèi)滅菌20～30min。