[發明專利]一種中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法

在審

• 申請號: 202011462201.5
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112514795A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 李威亞;潘美紅;陳微;惠林沖;楊海峰;繆美華;何林玉
• 申請（專利權）人: 連云港市農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 李德濺

1.一種中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：該方法步驟如下：

a、5月份洋蔥抽薹時架設防蟲隔離網，選擇已開放個別花蕾的花球并剪取帶3～5cm花葶的花球，塑料袋包裝后放入冰箱冷藏預處理；

b、在MS基礎培養基中加入2mg/L的2，4-D＋2mg/L的6-BA＋100g/L的蔗糖＋7g/L的瓊脂、用1%NaOH調其pH值至5.8～6.1配制成MS誘導培養基，并將MS誘導培養基倒入培養瓶后進行滅菌處理；

c、從冰箱取出預處理的花球，選擇花球中的未開放花蕾，用鑷子摘除未開放花蕾的上萼片及花瓣且切留2～3mm花梗后，包裹入紗布流動凈水沖洗；

d、超凈工作臺中對沖洗后的花蕾消毒后用濾紙吸干水分，鑷子夾取花蕾插入步驟b滅菌處理后的MS誘導培養基中，每個培養瓶插植13～17個花蕾，完成后放置在組培室中培養；

e、組培室中培養70～90天，移入新的MS誘導培養基中進行繼代移植培養；

f、在B5基礎培養基中加入30g/L的蔗糖＋7g/L的瓊脂、用1%NaOH調其pH值至5.8～6.1配制成B5再生培養基，并將B5再生培養基倒入培養瓶后進行滅菌處理；

g、待繼代移植培養的花蕾產生胚狀體后，將胚狀體移入步驟f滅菌處理后的B5再生培養基中，每個培養瓶插植3～6個胚狀體，完成后放置在組培室中培養；

h、胚狀體發育成再生植株后，取植株葉片并用流式細胞儀檢測倍性，驗證單倍體植株并移至裝有基質的營養缽中，在玻璃室中馴化培養至單倍體植株正常生長后移栽至室外大田。

2.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟a中的冰箱冷藏預處理的冷藏溫度為0～4℃、預處理時間為5～7天。

3.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟b和步驟f中的滅菌處理的過程為：將配制好的MS誘導培養基或B5再生培養基倒入對應的帶有透氣孔蓋的培養瓶，培養瓶擰蓋后放入120℃的高壓鍋內滅菌20～30min。

4.根據權利要求3所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：每個培養瓶中倒入30～50ml的MS誘導培養基或B5再生培養基，培養瓶的規格為240ml。

5.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟c中的未開放花蕾的挑選標準為花蕾直徑達3～5.5mm。

6.根據權利要求1或5所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟c中的流動凈水沖洗時間為20～30min。

7.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟d中的花蕾消毒方法為：先用70%酒精消毒20～30s，取出超純無菌水沖洗2～3次；再放入10%濃度次氯酸鈉溶液消毒7～10min，超純無菌水沖洗2～3次。

8.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟d、步驟e和步驟g中的組培室的室內條件設置為恒溫25℃、光強30～35umol/m²/s、光照時間16～20h/d。

9.根據權利要求1所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟h中的再生植株生長至3葉一心后取植株葉片并用流式細胞儀檢測倍性，驗證單倍體植株并移至裝有基質的營養缽中，在玻璃室中馴化培養20～30天，4～5葉一心完成馴化移栽至室外大田。

10.根據權利要求1或9所述的中日照品種洋蔥大孢子單倍體的培養方法，其特征在于：所述步驟h中的單倍體植株在室外大田中生長時，需要觀察植株開花結子情況并再次驗證單倍性。