[發(fā)明專利]一種間皮素嵌合抗原受體外泌體、及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011460904.4
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112574953A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊鵬翔;接晶;楊宇民
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;A61K45/06;A61P35/00
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

1.一種間皮素CAR外泌體，其中，所述外泌體包含靶向間皮素的部分，所述靶向間皮素的部分的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1；

優(yōu)選地，所述外泌體具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

2.一種制備權(quán)利要求1所述的間皮素CAR外泌體的方法，其中，所述方法包括：

（1）通過分離和培養(yǎng)，得到免疫細(xì)胞；

（2）采用包含或表達(dá)間皮素的活化劑，對所述免疫細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性活化并進(jìn)行培養(yǎng)，得到CAR免疫細(xì)胞；

（3）從所述CAR免疫細(xì)胞的培養(yǎng)上清中收集包含CAR免疫細(xì)胞外泌體的沉淀物；

（4）對所述沉淀物進(jìn)行純化和富集，得到純化后的間皮素CAR外泌體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞是T細(xì)胞或NK細(xì)胞；

優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞來源于健康志愿者血液；

優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞為T細(xì)胞，并且按照以下步驟制備所述免疫細(xì)胞：

a）從受試者外周血中分離PBMC，在磁珠的存在下分離和激活T細(xì)胞；

b）將所述T細(xì)胞在用補充有白細(xì)胞介素的基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，得到所述免疫細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，通過如下進(jìn)行所述抗原特異性活化：向所述免疫細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入所述抗原或固化的所述抗原或表達(dá)所述抗原的病毒顆粒、或者將所述免疫細(xì)胞和表達(dá)所述抗原的滅活后的工程細(xì)胞共培育、或者將所述免疫細(xì)胞和表達(dá)所述抗原的滅活后腫瘤細(xì)胞共培育；

優(yōu)選地，所述的活化劑為間皮素重組蛋白、磁珠交聯(lián)的間皮素重組蛋白、表達(dá)間皮素的MDA-MB-231細(xì)胞、表達(dá)間皮素的病毒顆粒；更優(yōu)選地，所述的活化劑為間皮素重組蛋白；

優(yōu)選地，通過如下進(jìn)行所述抗原特異性活化：將編碼間皮素重組蛋白的核酸序列插入慢病毒載體中，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的表達(dá)有所述間皮素重組蛋白的病毒顆粒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞；

優(yōu)選地，所述CAR免疫細(xì)胞為CAR-T細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項所述的方法，其特征在于，通過如下方法制備所述包含CAR免疫細(xì)胞外泌體的沉淀物：將所述培養(yǎng)上清于200-500g下離心3-8分鐘，以去除死細(xì)胞和大的碎片，得到初步離心的上清液；將所述初步離心的上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，于8000-12000g下離心20-40分鐘，以去除細(xì)胞器及小顆粒，得到二次離心的上清液；將所述二次離心的上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，于80000-120000g下離心50-80分鐘，棄去上清，加入PBS清洗，然后于80000-120000g下離心50-80分鐘，得到所述沉淀物；

優(yōu)選地，利用PBS對所述沉淀物進(jìn)行重懸，然后向其中加入所述抗原包被的磁性體；通過磁力進(jìn)行初步分離，得到分離后的磁性體，向其中加入PBS緩沖液重懸，通過緩沖液洗脫來進(jìn)行分選，得到純化后的間皮素CAR外泌體；

優(yōu)選地，所述抗原包被的磁性體為間皮素重組蛋白包被的Dynabeads。

6.一種包含權(quán)利要求1所述的間皮素CAR外泌體的藥物組合物或抗體偶聯(lián)物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物或抗體偶聯(lián)物，其特征在于，所述藥物組合物或抗體偶聯(lián)物還包含：細(xì)胞毒類藥物；影響核酸合成的藥物；作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物；主要作用于微管蛋白合成的藥物；激素類抗雌激素；芳香化酶抑制劑、激動劑/拮抗劑；生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；白細(xì)胞介素-2；胸腺肽類藥物；或者單克隆抗體；

優(yōu)選地，所述細(xì)胞毒類藥物選自順鉑、卡鉑和草酸鉑；所述影響核酸合成的藥物選自甲氨喋呤和氟尿嘧啶類藥物；所述作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物選自放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素和表阿霉素；所述主要作用于微管蛋白合成的藥物選自紫杉醇、長春花堿和長春瑞濱；所述激素類抗雌激素選自屈洛昔芬和依西美坦；所述芳香化酶抑制劑、激動劑/拮抗劑選自來曲唑、瑞寧德、依那通；所述生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑選自主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；并且所述單克隆抗體選自美羅華、赫賽汀和Avastin。