[發明專利]一種間皮素嵌合抗原受體外泌體、及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011460904.4
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112574953A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 楊鵬翔;接晶;楊宇民
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;A61K45/06;A61P35/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

1.一種間皮素CAR外泌體，其中，所述外泌體包含靶向間皮素的部分，所述靶向間皮素的部分的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1；

優選地，所述外泌體具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

2.一種制備權利要求1所述的間皮素CAR外泌體的方法，其中，所述方法包括：

（1）通過分離和培養，得到免疫細胞；

（2）采用包含或表達間皮素的活化劑，對所述免疫細胞進行抗原特異性活化并進行培養，得到CAR免疫細胞；

（3）從所述CAR免疫細胞的培養上清中收集包含CAR免疫細胞外泌體的沉淀物；

（4）對所述沉淀物進行純化和富集，得到純化后的間皮素CAR外泌體。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫細胞是T細胞或NK細胞；

優選地，所述免疫細胞來源于健康志愿者血液；

優選地，所述免疫細胞為T細胞，并且按照以下步驟制備所述免疫細胞：

a）從受試者外周血中分離PBMC，在磁珠的存在下分離和激活T細胞；

b）將所述T細胞在用補充有白細胞介素的基本培養基進行培養和擴增，得到所述免疫細胞。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，通過如下進行所述抗原特異性活化：向所述免疫細胞的培養體系中加入所述抗原或固化的所述抗原或表達所述抗原的病毒顆粒、或者將所述免疫細胞和表達所述抗原的滅活后的工程細胞共培育、或者將所述免疫細胞和表達所述抗原的滅活后腫瘤細胞共培育；

優選地，所述的活化劑為間皮素重組蛋白、磁珠交聯的間皮素重組蛋白、表達間皮素的MDA-MB-231細胞、表達間皮素的病毒顆粒；更優選地，所述的活化劑為間皮素重組蛋白；

優選地，通過如下進行所述抗原特異性活化：將編碼間皮素重組蛋白的核酸序列插入慢病毒載體中，然后轉染宿主細胞進行擴增，將得到的表達有所述間皮素重組蛋白的病毒顆粒轉染T細胞；

優選地，所述CAR免疫細胞為CAR-T細胞。

5.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，其特征在于，通過如下方法制備所述包含CAR免疫細胞外泌體的沉淀物：將所述培養上清于200-500g下離心3-8分鐘，以去除死細胞和大的碎片，得到初步離心的上清液；將所述初步離心的上清液轉移到新離心管中，于8000-12000g下離心20-40分鐘，以去除細胞器及小顆粒，得到二次離心的上清液；將所述二次離心的上清液轉移到新離心管中，于80000-120000g下離心50-80分鐘，棄去上清，加入PBS清洗，然后于80000-120000g下離心50-80分鐘，得到所述沉淀物；

優選地，利用PBS對所述沉淀物進行重懸，然后向其中加入所述抗原包被的磁性體；通過磁力進行初步分離，得到分離后的磁性體，向其中加入PBS緩沖液重懸，通過緩沖液洗脫來進行分選，得到純化后的間皮素CAR外泌體；

優選地，所述抗原包被的磁性體為間皮素重組蛋白包被的Dynabeads。

6.一種包含權利要求1所述的間皮素CAR外泌體的藥物組合物或抗體偶聯物。

7.根據權利要求6所述的藥物組合物或抗體偶聯物，其特征在于，所述藥物組合物或抗體偶聯物還包含：細胞毒類藥物；影響核酸合成的藥物；作用于核酸轉錄的藥物；主要作用于微管蛋白合成的藥物；激素類抗雌激素；芳香化酶抑制劑、激動劑/拮抗劑；生物反應調節劑；白細胞介素-2；胸腺肽類藥物；或者單克隆抗體；

優選地，所述細胞毒類藥物選自順鉑、卡鉑和草酸鉑；所述影響核酸合成的藥物選自甲氨喋呤和氟尿嘧啶類藥物；所述作用于核酸轉錄的藥物選自放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素和表阿霉素；所述主要作用于微管蛋白合成的藥物選自紫杉醇、長春花堿和長春瑞濱；所述激素類抗雌激素選自屈洛昔芬和依西美坦；所述芳香化酶抑制劑、激動劑/拮抗劑選自來曲唑、瑞寧德、依那通；所述生物反應調節劑選自主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；并且所述單克隆抗體選自美羅華、赫賽汀和Avastin。