[發明專利]細胞外基質MB生物蛋白及其制備試劑盒與方法

有效

• 申請號: 202011460598.4
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112538513B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 肖鍔
• 申請（專利權）人: 湖南美柏生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/78;C07K14/47;C12N5/0775;A61L27/22;A61L27/24;A61L27/36
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 修雪靜

1.一種利用人間充質干細胞生產細胞外基質MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

將人源間充質干細胞于完全培養基中培養至細胞匯合度為75％～90％，加入加藥誘導劑，進行誘導培養3～5天，獲得誘導期細胞培養物，所述加藥誘導劑包括在a-MEM或者DMEM中加入如下濃度的組分：

1～3ng細胞生長因子bFGF；

3～12ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；

5～15ng/mL胰島素樣生長因子IGF-1；

3～10ng/mL轉化生長因子TGF-β1；

3～10ng/mL地塞米松；

0.5～1.5％細胞培養添加物ITS；

將所述誘導期細胞培養物于維持期培養基中，并加入大分子刺激藥物進行維持培養3～5天，獲得維持期細胞培養物；

將所述維持期細胞培養物于加速期培養基中，并加入大分子刺激藥物進行加速培養2～4天，獲得加速期細胞培養物；

將所述加速期細胞培養物加入脫細胞液，獲得所述細胞外基質MB生物蛋白；所述維持期培養基按體積份數計包括：

α-MEM或者DMEM 100份；

胎牛血清2～9份；

青鏈霉素混合液0.5～1.5份；

谷氨酰胺0.5～1.5份；

抗壞血酸；所述抗壞血酸的終濃度為100～200uM；

所述大分子刺激藥物包括30～100ug/mL卡拉膠、0.01～1mg/mL黃原膠和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一種；

所述細胞外基質MB生物蛋白以質量分數計包括：10％～30％的一型膠原α1鏈、10％～20％一型膠原的α2鏈、10％～30％三型膠原α1鏈、10％～30％彈性蛋白、3％～15％的纖維黏連蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％層黏連蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種利用人間充質干細胞生產細胞外基質MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述加速期培養基按體積份數計包括：

α-MEM或者DMEM 100份；

胎牛血清5～15份；

青鏈霉素混合液0.5～1.5份；

谷氨酰胺0.5～1.5份；

抗壞血酸；所述抗壞血酸的終濃度為100～200uM。

3.根據權利要求1所述的一種利用人間充質干細胞生產細胞外基質MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述人源間充質干細胞為第3～10代；所述人源間充質干細胞包括人源脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、牙髓間充質干細胞、牙周膜間充質干細胞和臍帶間充質干細胞中的一種。

4.根據權利要求1所述的一種利用人間充質干細胞生產細胞外基質MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述誘導培養、所述維持培養和所述加速培養均于5％CO₂，溫度37℃的條件下進行。

5.一種細胞外基質MB生物蛋白，其特征在于，所述細胞外基質MB生物蛋白根據權利要求1-4中任一項所述的利用人間充質干細胞生產細胞外基質MB生物蛋白的方法制備獲得，所述細胞外基質MB生物蛋白以質量分數計包括：10％～30％的一型膠原α1鏈、10％～20％一型膠原的α2鏈、10％～30％三型膠原α1鏈、10％～30％彈性蛋白、3％～15％的纖維黏連蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％層黏連蛋白。

6.權利要求5所述的細胞外基質MB生物蛋白在細胞移植、再生醫學或者組織工程中的應用。