[發(fā)明專利]一株重組新城疫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011459211.3
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112501139B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何金嬌;孫國鵬;鄧麗珠;吳云舟;徐鑫;李鵬;吳玉蘋;張萬方;邊瑞鵬;劉瑞涵
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)學(xué)院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/62;A61K39/17;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

本發(fā)明公開了一株重組新城疫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一株重組新城疫病毒毒株，為將VP2蛋白的編碼基因和雞IgG的Fc通過GS linker連接插入到雞新城疫病毒毒株Clone30基因組的F和HN基因之間得到的重組病毒株。本發(fā)明通過在現(xiàn)有新城疫活疫苗基因組中引入雞傳染性法氏囊超強(qiáng)毒株的VP2?Fc基因片段，在有效保護(hù)雞群免受新城疫的入侵的同時，可以產(chǎn)生較高的雞傳染性法氏囊病的抗體，可以達(dá)到有效免疫效果和保護(hù)作用；本發(fā)明對于雞傳染性法氏囊病和新城疫的防治具有重大價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一株重組新城疫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和新城疫(NewcastleDisease,ND)為禽類2種重大疫病。自上世紀(jì)80年代以來，歐洲及我國相繼出現(xiàn)IBDV超強(qiáng)毒株的流行，該病能夠引起雞免疫機(jī)能障礙，對其他疾病的易感性增加；新城疫具有很高的發(fā)病率和病死率，也給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，預(yù)防和控制這兩種烈性傳染病對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有重要意義。

IBD疫苗接種后對雞的法氏囊產(chǎn)生一定的破壞作用，從而影響其它疫苗的免疫效果。因此使用法氏囊卵黃抗體進(jìn)行被動免疫已經(jīng)成為預(yù)防和治療IBDV感染的常規(guī)手段。然而，法氏囊卵黃抗體除了成本高外，還存在嚴(yán)重的垂直和水平傳播疾病的風(fēng)險。此外，用動物材料生產(chǎn)生物制品給質(zhì)量控制帶來無法克服的困難。

按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行單苗免疫，既費時又費力。隨著反向遺傳操作技術(shù)的成熟，表達(dá)外源保護(hù)性抗原基因的重組NDV二聯(lián)或載體疫苗取得了一定的進(jìn)展。在實踐免疫過程中，表達(dá)的外源保護(hù)性抗原的免疫效果不理想，其原因主要是外源基因在脫離病原體后半衰期變短，少則幾分鐘，多不過數(shù)小時，所以抗原濃度很難達(dá)到引起足夠的抗體反應(yīng)的程度。

傳染性法氏囊病是一種由雞傳染性法氏囊病病毒引起的危害3-12周齡青年雞的急性、高度接觸性傳染病。IBDV屬于雙RNA病毒科的禽雙RNA病毒屬，其基因組由A和B兩個節(jié)段組成。研究表明，VP2蛋白具有血清型特異性位點，VP2能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)性的中和抗體，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒的血清中和抗體，是該病毒的主要抗原。

免疫球蛋白IgG在體內(nèi)的半衰期為20d，其穩(wěn)定性是由于IgG的Fc片段與新生Fc受體(FcRn)結(jié)合，避免IgG進(jìn)入溶酶體中被降解。因此，IgG的Fc片段被用來與活性蛋白連接構(gòu)成融合蛋白，以提高活性蛋白的體內(nèi)半衰期，達(dá)到長效的目的。NDV作為一種活病毒載體具有獨特的優(yōu)勢，其安全性和有效性均已被充分證明，而且目前新城疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)現(xiàn)已成熟。

因此，提供一株重組新城疫病毒毒株用于預(yù)防雞新城疫和雞傳染性法氏囊病是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一株重組新城疫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株重組新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc，為將VP2蛋白的編碼基因和雞IgG的Fc通過GS linker連接插入到雞新城疫病毒毒株Clone30基因組的F和HN基因之間得到的重組病毒株；所述rClone30-VP2-Fc病毒的基因組序列為SEQ ID NO.2自5’末端第2703-20322位核苷酸序列。

進(jìn)一步，一株重組新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc的制備方法，具體步驟如下：

(1)合成VP2-Fc的雙鏈DNA分子，如SEQ ID NO.1所示；

(2)分別采用限制性內(nèi)切酶Hpa I和Mlu I雙酶切步驟(1)的雙鏈DNA分子和pClone30質(zhì)粒，回收，連接，得到重組質(zhì)粒pClone30-VP2-Fc；