[發(fā)明專利]一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011459198.1
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112462060A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設計）人: 李鵬;李紅;王選年;王利平;劉興友;劉長忠;劉明成;孫國鵬;岳鋒;張艷芳
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明公開的一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法，細胞反應板可提前制備，可在?20℃長期保存；反應結果可用熒光顯微鏡進行觀察。IFA檢測具有特異性強、敏感性高、操作簡單的特點；且IFA方法利用活病毒接種，使用的是全病毒，抗原結構更加完整，結果更具有準確性和代表性。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體的說是涉及一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法。

背景技術

豬瘟(Classical Swine Fever)，早期稱豬霍亂(Hog Cholera,HC)，是由豬瘟病毒(Classical Swine FeverVirus,CSFV)引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，其特征為高熱稽留和全身廣泛性出血。豬瘟的發(fā)病率和死亡率都很高，主要分為急性型、亞急性型、慢性型、非典型豬瘟或溫和型豬瘟，給全世界養(yǎng)豬產業(yè)造成巨大的經濟損失。其在世界各地均有不同程度的流行，我國將此病列為一類動物疾病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病。豬瘟病毒(CSFV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，是RNA病毒，具有感染性。在自然條件下，豬還可能感染與豬瘟病毒(CSFV)同屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)和綿羊邊界病病毒(Borderdisease Virus，BDV)，但是CSFV卻只對豬有致病性。雖然CSFV對其他動物沒有致病性，但是它可以在小鼠、牛和山羊等動物體內進行增殖。目前，豬瘟防治的主要措施是疫苗免疫，我國學者周泰沖等研究的C株豬瘟兔化弱毒疫苗、法國的Thiverval株弱毒疫苗和日本的細胞弱毒疫苗等弱毒疫苗成功問世，并在豬瘟防治中起著重要作用。現(xiàn)在我國使用的疫苗主要有豬瘟兔化弱毒疫苗，脾淋苗及牛睪丸疫苗。這些疫苗已經能夠很好的控制豬瘟的流行，但是由于疫苗的長期使用，致使豬瘟在流行上發(fā)生了較大的改變，主要變?yōu)榉堑湫托载i瘟和溫和性豬瘟。這造成了豬瘟診斷及防治的困難，也使得豬瘟一直流行，困擾著中國養(yǎng)豬業(yè)。基于此，建立快速準確的診斷方法和研究其感染機制對CSFV的綜合防控具有重要意義。

因此，提供一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種CSFV的IFA(間接免疫熒光)中和抗體檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種CSFV的IFA中和抗體檢測方法，具體步驟如下：

(1)將PK15細胞消化離心后制備成含1.0×10⁵cells/mL的細胞懸液，每孔100μL鋪到96孔板上，置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，待細胞完全貼壁，將等體積的CSFV病毒液和臨床血清37℃孵育1h，然后接種到96孔板內的PK15細胞上，培養(yǎng)48h待細胞長滿后取出96孔板；同時設立正常接毒細胞對照孔；

(2)用預冷的無水乙醇固定，加入預冷的無水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min；棄去無水乙醇，PBST清洗，拍干；

(3)加入5％的脫脂奶粉進行封閉，每孔200μL，37℃溫箱放置2h；PBST清洗，拍干；

(4)加入CSFV陽性抗體，用PBS按照1:400稀釋，每孔加入50μL，37℃溫箱放置1h；PBST清洗，拍干；

(5)加入羊抗豬IgG-FITC，用PBS按照1:100稀釋，每孔加入50μL，37℃溫箱放置1h，PBST清洗；最后每孔加入PBST 50μL，在倒置熒光顯微鏡進行觀察。

進一步，所述CSFV病毒液的制備方法如下：將臨床采集的病料組織進行研磨，按照1mg組織樣品加入1mL PBS溶解，反復凍融3次，取上清；12000rpm離心5min，用0.22μm濾器過濾，獲得CSFV病毒液。