[發明專利]一種基于花菁類染料熒光分析的DNA瞬態構象變化的檢測方法

在審

• 申請號: 202011458068.6
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112505011A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 樊春海;王麗華;沈建磊;李江;陳斌;黃秋靈
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 余永莉

本發明提供一種基于花菁類染料熒光分析的DNA瞬態構象變化的檢測方法，包括以下步驟：1)提供一種花菁類染料，通過柱分離提純，并通過單晶衍射、核磁共振和質譜中的至少后面兩種來對其進行結構表征，然后將花菁類染料溶于二甲亞砜，制成花菁類染料的二甲亞砜溶液；2)將花菁類染料的二甲亞砜溶液與雙鏈DNA、G四聯體、i?motif或質粒DNA混合孵育，通過測量熒光光譜，并對單體和激基締合物的熒光發射強度進行分析，即可實現對所述DNA瞬態構象變化的檢測；其中，花菁類染料具有如式(I)所示的結構通式。根據本發明，提供了一種基于花菁類染料熒光分析的、操作簡單的、樣品用量少的、靈敏度高的DNA瞬態構象變化的檢測方法。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，特別是涉及一種基于花菁類染料熒光分析的DNA瞬態構象變化的檢測方法。

背景技術

DNA作為遺傳信息，是生物體發育和正常運作必不可少的生物大分子。DNA構象變化是發育和疾病期間基因調控的關鍵機制。基因組中G-四鏈體，i-motif和Z-DNA結構的微小畸變將導致DNA結構紊亂并引起基因遺傳疾病，例如Friedreich共濟失調(FRDA)、脆性X綜合征(FRAX)、亨廷頓氏病和強直性肌營養不良(DM)。表征DNA結構構象變化的標準方法包括單晶X射線衍射，低溫透射電子顯微鏡(cryo-TEM)和原子力顯微鏡(AFM)。但是，這些技術需要大量的樣品處理，并且僅捕獲DNA的靜態，對瞬時構象變化進行實時測量在技術上具有挑戰性。

迄今為止，已開發出各種技術來檢測DNA的構象和拓撲變化。其中，共振能量轉移(FRET)是探究構象動力學的一種常用技術。例如，通過特定的給體和受體基團共價連接DNA后，用單分子FRET觀測DNA自發地局部變性。但是FRET技術的需要對疏水性熒光團進行位點特異性修飾，這會擾亂DNA結構的穩定性。因此，亟需一種非共價修飾的熒光技術來表征DNA構象的變化。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于花菁類染料熒光分析的DNA瞬態構象變化的檢測方法，從而解決現有技術中缺乏檢測DNA瞬態構象變化的方法的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

提供一種基于花菁類染料熒光分析的DNA瞬態構象變化的檢測方法，包括以下步驟：1)提供一種花菁類染料，通過柱分離提純，并通過單晶衍射、核磁共振和質譜中的至少后面兩種來對其進行結構表征，然后將所述花菁類染料溶于二甲亞砜，制成所述花菁類染料的二甲亞砜溶液；2)將步驟1)中制得的所述花菁類染料的二甲亞砜溶液與雙鏈DNA、G四聯體、i-motif或質粒DNA混合孵育，通過測量熒光光譜，并對單體和激基締合物的熒光發射強度進行分析，即可實現對所述雙鏈DNA、G四聯體、i-motif或質粒DNA的瞬態構象變化的檢測；

其中，所述花菁類染料具有如下式(I)所示的結構通式：

R¹～R²為獨立的C_1-18的烷基；X¹、X²和X³為鹵原子。優選地，所述的烷基為甲基、乙基、丙基或丁基，X¹和X²為氯原子或溴原子，X³為溴原子或碘原子。

應當知曉的是，具有如式(I)所示的結構通式的花菁類染料的制備方法可參見文獻1(Bioconjug Chem.2017,28,1552-1559.)。

還應當理解的是，步驟1)中，針對已知結構的花菁類染料，其結構表征通過核磁共振和質譜兩種分析方法即可，而針對未知結構的花菁類染料，其結構表征需通過單晶衍射、核磁共振以及質譜三種分析方法共同實現。