[發明專利]一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記及其應用

在審

• 申請號: 202011457366.3
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112410459A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 劉毅;王飛名;張安寧;孔德艷;劉國蘭;余新橋;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 張秋菊

本發明提供了一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記及其應用，屬于農業生物技術領域。本發明根據Pi25基因編碼區的775bp和2687bp處目的基因關鍵特異性位點設計兩對引物Pi25?K775和Pi25?K2680/2687，以水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增，然后對擴增產物進行信號掃描分析，目的基因進行基因分型。本發明利用基于KASP反應原理及抗感材料Pi25基因編碼區內的單堿基差異設計的KASP標記能高通量的對水稻材料進行Pi25基因檢測，兩對KASP分子標記能相互驗證，避免實驗過程中的誤差，達到更高的準確率。具有簡便、可靠、快速、特異性強、靈敏度高、環境友好的顯著優點，適用于Pi25基因的鑒定分型和抗水稻稻瘟病品種的輔助選擇育種。

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，尤其涉及一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記及其應用。

背景技術

稻瘟病是目前水稻生產上最具毀滅性的真菌性病害之一，在世界種植水稻的各稻區均有分布并持續發生，嚴重影響水稻產量，給糧食的安全帶來了極大的隱患。實踐表明，培育和推廣抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最為經濟、有效、安全和環保的措施。

傳統的水稻抗病育種是通過抗性鑒定對植株進行表型選擇，耗費時間長，且易受環境條件的限制，鑒定結果容易造成誤差，選擇效率較低。利用分子標記輔助選擇育種簡單有效，可以降低育種成本，縮短選育周期，亦可進行有目的的多基因聚合，提高育種效率。目前文獻報道中主要利用的標記類型為CAPS標記(王慧梅等，作物學報，38(11):1960-1968)，連鎖標記(RM3330，SA7和Si1370C)(朱玉君等，福建稻麥科技，2010，28(01)：1-3)，特異性顯性標記(專利號：200910152617.4)，和特異性共顯性標記(申請號：201610014679.9)。在實踐應用中，CAPS標記需要酶切，過程繁瑣；連鎖標記存在多態率較低，差異較小的缺點，特異性標記限制條件較多，擴增不穩定，以上標記在檢測過程中使用的EB或聚炳烯酰胺易對環境造成污染、對人體產生危害。

競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive allele specific PCR KASP)分子標記是一種基于SNP的新型基因分型技術。KASP技術具有穩定性好和準確性高、高通量，檢測成本較低等優點，近年來得到快速的發展(He et al，Methods Mol Biol，2014，1145，75-86)。Pi25基因源自秈稻品種谷梅2號，是克隆的24個稻瘟病抗性基因之一，對稻瘟病具有廣譜抗性，對于培育具有抗稻瘟病水稻品種具有很大的利用價值(Chen et al，J GenetGenomics,38:209-216)。開發與抗稻瘟病基因Pi25共分離的特異性分子標記及建立高效、環境友好的相關檢測體系，則對促進Pi25基因在抗稻瘟病育種中的應用具有重要意義。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記，具有簡便、可靠、快速、特異性強、靈敏度高、環境友好的顯著優點，而且本發明的兩對KASP分子標記能相互驗證，避免實驗過程中的誤差，達到更高的準確率，可應用于篩選、鑒定或培育抗水稻稻瘟病品種中。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2兩段核苷酸序列。

本發明還提供了一種擴增上述分子標記的引物組，包括Pi25-K775引物組和Pi25-K2680/2687引物組；

所述Pi25-K775引物組為：

Pi25-K775-F1：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’、

Pi25-K775-F2：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’、