[發明專利]一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記及其應用

在審

• 申請號: 202011457366.3
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112410459A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 劉毅;王飛名;張安寧;孔德艷;劉國蘭;余新橋;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 張秋菊

1.一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記，其特征在于：包括SEQ ID NO.1和SEQID NO.2兩段核苷酸序列。

2.一種權利要求1所述分子標記的擴增引物組，其特征在于，包括Pi25-K775引物組和Pi25-K2680/2687引物組；

所述Pi25-K775引物組為：

Pi25-K775-F1：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’、

Pi25-K775-F2：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’、

Pi25-K775-Commonprimer：5’-TTCGACCAAGCCTCTGTAATTTGTGA-3’，

所述Pi25-K2680/2687引物組為：

Pi25-K2680/2687-F1：5’-GTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCC-3’、

Pi25-K2680/2687-F2：5’-CGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCT-3’、

Pi25-K2680/2687-Commonprimer：

5’-TCATACAGCAGAAGAGCTTGTGGAT-3’。

3.根據權利要求2所述的擴增引物組，其特征在于，所述引物Pi25-K775-F1和Pi25-K2680/2687-F1的5’端添加有FAM熒光標簽序列，所述Pi25-K775-F2和Pi25-K2680/2687-F2的5’端添加有HEX熒光標簽序列。

4.一種檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)提取待測水稻基因組DNA；(2)利用權利要求2-3任一項所述的兩組引物以水稻基因組DNA為模板，進行PCR擴增；(3)對PCR擴增產物進行熒光掃描；(4)分析等位基因分型結果。

5.根據權利要求4所述的檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴增的反應體系按體積份數計包括2×KASP Master mix 5份、KASPPrimer mix 0.14份、模板DNA 1份、ddH₂O 3.86份組成，其中模板DNA的濃度為20ng/μL；

所述步驟(2)中PCR擴增的反應程序為：階段1：94℃預變性15min；階段2：94℃變性20s，65℃～57℃退火延伸60s，10個循環，每個循環降低0.8℃；階段3：94℃變性20s，57℃退火延伸60s，26個循環。

6.根據權利要求5所述的檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記方法，其特征在于：所述KASP Primer mix由權利要求1所述Pi25-K775引物組或Pi25-K2680/2687引物組組成，其中Pi25-K775-F1、Pi25-K775-F2和Pi25-K775-Common primer的用量比例為1:1:2.5，Pi25-K2680/2687-F1、Pi25-K2680/2687-F2和Pi25-K2680/2687-Common primer的用量比例為1:1:2.5。

7.根據權利要求4所述的檢測抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子標記方法，其特征在于，所述步驟(4)具體為：

若同時檢測到Pi25-K775-FAM對應的堿基G和Pi25-K2680/2687-FAM對應的堿基G，則判斷待測水稻含有純和的Pi25基因；

若只檢測到Pi25-K775-HEX對應的堿基A，或只檢測到Pi25-K2680/2687-HEX對應的堿基A，或同時檢測到Pi25-K775-HEX對應的堿基A和Pi25-K2680/2687-HEX對應的堿基A，則判斷待測水稻不含有Pi25基因；

若同時檢測到堿基G和A，則判斷待測水稻含有雜合的Pi25基因。

8.權利要求1所述分子標記或權利要求2-3任一項所述擴增引物組在篩選、鑒定或培育抗水稻稻瘟病品種中的應用。