[發明專利]一種對外界環境中可利用磷酸鹽濃度變化發生感應的分子元件及其突變分子元件和應用

有效

• 申請號: 202011457226.6
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112481258B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 靳豪杰;付玉杰;孟冬;楊清;王立濤;張謖;牛麗麗
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N1/13;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/89
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了一種對外界環境中可利用磷酸鹽濃度變化發生感應的分子元件及其突變分子元件和應用，屬于分子生物學技術領域。一種對外界環境中可利用磷酸鹽濃度變化發生感應的分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述分子元件在有機膦降解或構建有機膦降解的轉基因微生物中的應用。本發明還提供了一種對外界環境中可利用磷酸鹽濃度變化發生感應的突變分子元件，在所述分子元件的基礎上將Pho box3結構域突變為TGCCGGCC，該突變分子元件在藍細菌中表現出比野生型分子元件靈敏度更高的磷酸鹽檢測能力，與熒光報告基因相連導入微生物中，可用于環境中可利用磷濃度的精細檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種對外界環境中可利用磷酸鹽濃度變化發生感應的分子元件及其突變分子元件和應用。

背景技術

磷元素是一切生命體的必需成分，是遺傳物質包括DNA，RNA以及生命活動的體現物質蛋白質的重要組成部分。作為在植物生長過程中必須的，不可或缺的大量元素，是否有充足的磷源常常成為植物生長的重要限制因素^[1]。自然界中磷元素除了以PO4^3-正磷酸形式存在的無機磷狀態以外^[2]，還有許多的以C-O-P鍵形式的單磷酸脂類或者以C-P鍵形式存在的有機膦所含的磷元素物質。其中含有C-P鍵的有機膦可能是光合作用發生以前地球處于無氧狀態下磷元素存在的主要形式，早期微生物等生命體可能利用有機膦作為自己的能源及營養物質^[3]。因此研究有機膦在生命有機體中的循環利用有著重要的生長進化以及生態意義，尤其是在海洋以及人為干涉較少的自然生態比如野生林系統當中，微生物通過降解有機膦可以給生態系統中的其他生命體提供磷源及營養。

隨著工業化時代的發展，很多工業以及生活的必需品中都含有大量的有機膦成份，包括染料，抗生素，洗滌劑，農藥等產品中都含有有機膦成分^[4-5]。大量工業有機膦組份的合成，排放以及該類物質較強的抗降解能力使其越來越多的成為環境生態修復關注的熱點問題。有機膦生物降解修復以其綠色，環保以及較為溫和的運行條件使其成為了微生物以及環境生態學家日益關注的重要議題。不同與以無機狀態PO4^3-存在的正磷酸可以直接被多數生命體包括植物所吸收利用，有機膦的降解利用卻主要集中在原核生物以及一些酵母和真菌當中^[6]。并且微生物當中有機膦降解方面的功能和發生會受到環境中無機磷的存在及濃度的影響。目前有機膦的降解及調控研究主要集中在大腸桿菌當中，但是單位體積水體中所含的大腸桿菌數目是環境污染檢測的重要指標，所以利用環境友好的光合藍細菌作為有機膦降解生物工程改造的出發菌株將會是一個很好的替代。

最新的報道顯示具有有機膦降解基因簇的藍細菌菌株大約有27株，其僅占所有基因組測序藍細菌種類的5％左右^[7]。目前從實驗水平上驗證具有有機膦降解能力的藍細菌要么集中于海洋藍細菌如Nodularia spumigena^[7]和Trichodesmium^[8]，然而這些海洋藍細菌菌株生長非常緩慢且遺傳操作系統尚未建立或成熟；要么是一些絲狀藍細菌如Anabaenavariabilis^[9]和Nostoc^[8]，而絲狀藍細菌凝結聚集等特性不利于后繼的工業開發及應用優化。前期文獻報道中的一株分離自美國黃石國家森林公園熱泉中的嗜熱野生藍細菌Synechococcus OS-B’全基因組測序已經完成且在該菌株中鑒定到有機膦降解途徑的C-P裂解酶基因簇^[10]。實驗也已經證實該菌株具有有機膦降解和生物利用的能力，且可以在高溫環境下(50～60℃)進行有機膦的降解。該菌株所具有的耐高溫有機膦降解酶的優勢使我們對利用該菌的有機膦降解基因進行生物工程改造以及后繼利用開發產生了濃厚的興趣。

考慮到在利用微生物進行生物修復和降解環境及廢水中有機膦過程中不可避免的會面臨環境中所具有的無機磷成份的存在及其對有機膦的降解有一定程度的抑制作用，因此，急需提供一種指示環境中無機磷濃度的分子元件。