[發明專利]一種依色格南的制備方法

在審

• 申請號: 202011457219.6
• 申請日: 2020-12-13
• 公開（公告）號: CN112500454A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 劉連喜;王莉;印輝;李靖;曹恩清;張凱倫
• 申請（專利權）人: 江蘇新瑞藥業有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/08;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/113;C07K1/34;C07K1/20
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 劉俊玲

本發明公開了一種抗菌肽依色格南的制備方法，包括：以Fmoc?Linker?氨基樹脂為起始原料，采用Fmoc/tBu固相合成方法，利用偶聯劑按照依色格南的氨基酸序列依次將Fmoc?氨基酸連接至溶脹后的氨基樹脂上，得到全保護十七肽的肽樹脂；裂解液切割并脫除肽樹脂保護基，得到依色格南線性粗肽；液相一步空氣氧化，控制多肽溶液的濃度在0.5～5g/L范圍內，調節其pH值至8?10，使第5位與第14位、第7位與第12位間分別形成分子內二硫鍵，獲得依色格南粗品溶液；將依色格南粗品溶液過濾、分離純化、轉鹽和冷凍干燥，獲得依色格南三氟醋酸鹽或依色格南醋酸鹽。本發明采用固相與液相相結合的方式，將兩個二硫鍵的氧化簡化為一步反應，提高了產品的純度，粗肽產率大，有利于大規模工業化生產。

技術領域

本發明涉及一種小分子多肽化合物的制備，具體涉及依色格南(包括依色格南醋酸鹽、三氟醋酸鹽及游離肽)的制備方法。

背景技術

依色格南(Iseganan)是豬中性粒細胞肽-1的類似物，能與細菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等相結合，引起細菌膨脹、破裂，通過破壞細胞膜殺死細菌。其對革蘭氏陽性、陰性細菌及真菌、酵母菌等均有抑制作用。依色格南分子式為C₇₈H₁₂₆N₃₀O₁₈S₄，分子量為1900.2852，氨基酸序列如下：

依色格南是一類廣泛存在于動物、植物、昆蟲及人體內，由基因編碼并具有特定空間結構的小分子多肽，這種多肽是機體天然免疫的組成部分。抗菌肽具有廣譜高效的抗微生物學活性、水溶性好、熱穩定等優點。作為新型藥物，抗菌肽在人類治療和預防疾病過程中具有廣闊的開發應用前景。

現有技術中，已報道過多種依色格南的合成方法，例如專利CN102336813A報道了固相合成線性肽，然后在液相中成環的方法。該方法在固相中合成線性肽，切除固相上保護線性肽時脫除5和14位的半胱氨酸上的巰基保護基Trt，后用雙氧水氧化形成第一對二硫鍵(Cys^5-14)；再在碘的甲醇溶液中脫除7和12位的半胱氨酸的巰基保護基Acm，同時氧化形成第二對二硫鍵。王小青等2016年報道了另一種固相合成線性肽后經過兩次液相環化制備依色格南的方法，其兩次環化也使用了過氧化氫和碘氧化法。這類方法在第二對二硫鍵形成時需要用到大量的碘，導致很難進行后處理、產生廢液多，在產品中容易造成碘殘留、超標，且難以運用于大生產中。專利文獻CN103012563A報道了一種依色格南的固相合成方法，先按照固相合成的方法合成線性的十七肽氨基樹脂，然后采用固相成環方式，先脫除一種保護基并氧化生成第一對二硫鍵，再脫除另一種保護基并氧化生成第二對二硫鍵，最后脫除N端保護基，從氨基樹脂上裂解并去除側鏈保護基，純化得到依色格南。以上現有技術中不論是液相環化還是固相環化，都需要經過兩次脫保護基并氧化的過程，不僅工藝復雜，而且使用的氧化劑種類多、劑量大，生產成本高，也為后續處理造成困難，不適合工業化生產。

發明內容

本發明針對背景技術中涉及的這些問題(例如用碘氧化會產生大量廢液，且很難清除干凈等)，提供一種成本低廉、步驟精簡，收率大且純度高的依色格南的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種依色格南的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)以Fmoc-Linker-氨基樹脂為起始原料，采用Fmoc/tBu固相合成方法，利用偶聯劑按照依色格南的氨基酸序列依次將Fmoc-氨基酸連接至溶脹后的氨基樹脂上，得到全保護十七肽的肽樹脂；

(2)將步驟(1)得到的肽樹脂以裂解液切割，同時脫去所有側鏈保護基，再以冰乙醚沉淀切割液而獲得依色格南線性粗肽；