[發(fā)明專利]一種基于花粉管通道導(dǎo)入的水稻基因定向編輯方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011457190.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN112553244A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭濤;王加峰;陳淳;孟慶彬;黃翠紅;周丹華;黃明;肖武名;劉永柱;楊瑰麗;王慧;陳志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

1.一種基于花粉管通道導(dǎo)入的水稻基因定向編輯方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以水稻tms5基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)靶序列，所述靶序列SEQ ID No.1為：5’-GGCGGCGCCATGGCGAACAGCGG-3’；

(2)構(gòu)建步驟(1)中靶序列的gRNA表達(dá)盒；

(3)利用限制性內(nèi)切酶Bsa I和連接酶T4 ligase，將雙元表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9-MT與上述gRNA表達(dá)盒連接后插入雙元表達(dá)載體中，即得CRISPR/Cas9基因組編輯載體；

(4)將上述編輯載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，之后提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證；

(5)驗(yàn)證正確的質(zhì)粒采用花粉管通道遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)水稻進(jìn)行定向編輯。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，其特征在于，所述步驟(2)中靶序列的gRNA表達(dá)盒的構(gòu)建過程如下：(1)寡聚核苷酸鏈引物退火形成雙鏈接頭之后，用T4 DNA ligase連接至已酶切的U6a-gRNA載體，靶點(diǎn)接頭與gRNA載體連接；(2)gDNA表達(dá)盒擴(kuò)增：采用兩輪巢式PCR擴(kuò)增gDNA表達(dá)盒，第一輪所用引物為SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，第二輪所用引物為SEQ ID No.4-11。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，其特征在于，所述步驟(5)中花粉管通道遺傳轉(zhuǎn)化過程如下：

(1)水稻開花前，選取一個(gè)大部分小花正處于花期的穗子，剪去已開過的小花，待大部分小花開過花后，剪去未開的小花，穗子剩下的便是當(dāng)日剛開的小花，0.5-1.5小時(shí)后，剪去內(nèi)穎的一部分，下剪部位在剪去花柱靠近子房又不傷及子房的位置；

(2)水稻開花后的1.5～3h間進(jìn)行，選擇當(dāng)天開過的穎花，剔除其他已開和未開的穎花，用鑷子從內(nèi)外穎接縫處至上而下打開，用手固定避免穎殼閉合，剪掉柱頭，用微量進(jìn)樣器注入15μl的濃度為1μg/μl質(zhì)粒DNA以溶液填充籽粒為宜，合上穎殼套袋。