[發明專利]一種基于花粉管通道導入的水稻基因定向編輯方法

在審

• 申請號: 202011457190.1
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112553244A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 郭濤;王加峰;陳淳;孟慶彬;黃翠紅;周丹華;黃明;肖武名;劉永柱;楊瑰麗;王慧;陳志強
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發明公開了一種基于花粉管通道導入的水稻基因定向編輯方法，屬于生物技術領域。本發明利用花粉管通道將CRISPR/Cas9載體導入水稻胚囊，實現tms5目的基因的定向編輯。本發明建立的基于花粉管通道的基因定向編輯方法不依賴愈傷組織的遺傳轉化，并能獲得目的基因突變，操作過程簡單及可靠。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種基于花粉管通道導入的水稻基因定向編輯方法。

背景技術

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，當前，人口增加，耕地減少，環境污染，極端自然災害頻發，水稻糧食安全面臨嚴峻挑戰。傳統育種技術依賴雜交育種，不能滿足性狀定向改良，誘變育種又難以做到定點突變。雖然在基因組水平上進行水稻基因人工改造對作物的改良具有重要意義，但一直以來，科學家都未發現有效的植物基因組編輯技術。近年來，最新發現的CRISPR/Cas9技術憑借簡單和高效的特點被廣泛應用于水稻等作物的基因組編輯中。傳統的水稻遺傳轉化普遍是農桿菌介導法，通過Ti質粒將外源遺傳物質整合到受體基因組中。然而，農桿菌介導法對基因型的選擇性很強，秈稻相對于粳稻更難轉化，且轉化周期長，并且該方法需要一套復雜的人工組織培養過程，這都增大了遺傳轉化的困難性和復雜性。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于花粉管通道導入的水稻基因定向編輯方法。

為達上述目的，本發明采用如下的技術方案：

一種基于花粉管通道導入的水稻基因定向編輯方法，包括如下步驟：

(1)以水稻tms5基因為基礎設計靶序列，所述靶序列SEQ ID No.1為： 5’-GGCGGCGCCATGGCGAACAGCGG-3’；

(2)構建步驟(1)中靶序列的gRNA表達盒；

(3)利用限制性內切酶BsaI和連接酶T4ligase，將雙元表達載體pYLCRISPR/Cas9-MT 與上述gRNA表達盒連接后插入雙元表達載體中，即得CRISPR/Cas9基因組編輯載體；

(4)將上述編輯載體轉化大腸桿菌，之后提取質粒進行驗證；

(5)驗證正確的質粒采用花粉管通道遺傳轉化法對水稻進行定向編輯。

進一步的，所述步驟(2)中靶序列的gRNA表達盒的構建過程如下：(1)寡聚核苷酸鏈引物退火形成雙鏈接頭之后，用T4DNA ligase連接至已酶切的U6a-gRNA載體，靶點接頭與gRNA載體連接；(2)gDNA表達盒擴增：采用兩輪巢式PCR擴增gDNA表達盒，第一輪所用引物為SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，第二輪所用引物為SEQ ID No.4-11。

進一步的，所述步驟(5)中花粉管通道遺傳轉化過程如下：

(1)水稻開花前，選取一個大部分小花正處于花期的穗子，剪去已開過的小花，待大部分小花開過花后，剪去未開的小花，穗子剩下的便是當日剛開的小花，0.5-1.5小時后，剪去內穎的一部分，下剪部位在剪去花柱靠近子房又不傷及子房的位置；

(2)水稻開花后的1.5～3h間進行，選擇當天開過的穎花，剔除其他已開和未開的穎花，用鑷子從內外穎接縫處至上而下打開，用手固定避免穎殼閉合，剪掉柱頭，用微量進樣器注入15μl的濃度為1μg/μl質粒DNA以溶液填充籽粒為宜，合上穎殼套袋。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明驗證了基于CRISPR/Cas9技術的花粉管通道遺傳轉化法的可行性，花粉管通道法可作為一項不依賴于農桿菌的遺傳轉化技術運用到CRISPR/Cas9系統中，且能獲得較高的突變效率，操作過程簡單。

附圖說明

圖1為實施例1中擴增gRNA表達盒引物使用流程圖。