[發明專利]一種木霉屬真菌tef1分子標記基因簡并引物組及其應用

在審

• 申請號: 202011456879.2
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112375842A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 蔡楓;伊瑞娜·杜魯茲尼娜
• 申請（專利權）人: 奧世利華（蘇州）微生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州欣達共創專利代理事務所(普通合伙) 32405
• 代理人: 周升銘

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種木霉屬真菌tef1分子標記基因簡并引物組及其應用。本發明公開的簡并引物組，針對木霉屬真菌tef1分子標記基因的保守區域設計，可高效、精確、特異地進行擴增木霉屬真菌tef1標記基因的有效片段，提高了擴增成功率和精確度，減少實驗失敗重復數，突破了依賴于tef1分子標基因記鑒定木霉屬真菌的技術瓶頸。本發明公開的PCR反應體系，模板濃度需求低，檢測下限為4ng/μl模板DNA，檢測線低，檢測結果靈敏，鑒定成功率高。本發明所述的木霉屬真菌菌種鑒定方法，電泳后不需純化可直接用于測序，鑒定效率高。所述的木霉屬真菌菌種鑒定試劑盒，成分簡單，操作方便，適合大量樣本檢測，實用性好，經濟及市場價值高。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種木霉屬真菌tef1分子標記基因簡并引物組及其應用。

背景技術

木霉(Trichoderma spp.)是工農業生產重要的發酵和植物有益菌種，屬于子囊菌門(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)。木霉菌因其高度環境適應性，種群多樣性極高，這給菌種鑒定帶來巨大挑戰。目前用于木霉屬真菌菌種鑒定的主要分子標記常用ITS和rpb2基因片段，以及種間差異性較高的tef1 分子標記基因。

針對木霉tef1分子標記基因不同區域設計的簡并引物較多，但這些簡并引物擴增時不僅存在較多非特異擴增的現象，而且相應的擴增產物在后續測序時經常性地因為產物內的連續A堿基序列導致測序失敗。

現行最成功的為2003年Chaverri等人發表現有文獻Chaverri Priscila，Castlebury A.Lisa，Overton E.Barrie，Samuels J.Gary.(2003) Hypocrea/Trichoderma:species with conidiophore elongations and greenconidia.Mycologia,95(6),1100–1140.中所提到的EF1-983F和EF1-2218R 引物對，但該引物對在應用時也常會出現擴增產物不特異、擴增產物冗長等一系列問題。研究發現，tef1基因由6個相對保守的外顯子和5個相對多變的內含子組成，并不是整個tef1基因都具有實際意義的遺傳信息(即物種分類信息) 參考價值，因而并不需要對其全長進行擴增；而只需要完整地獲得第4至第5 內含子區域。而Chaverri等人發表的EF1-983F和EF1-2218R引物對在擴增時包含一段較長的第6外顯子區域，這部分序列在種間高度保守，無物種分類信息參考價值。

因此，tef1分子標記基因擴增一直是掣肘木霉屬真菌菌種鑒定的瓶頸之一；另一方面，由于并不是tef1整個基因都具有很高的遺傳信息(即物種分類信息)參考價值，因此，并不需要對其全長進行擴增。

發明內容

本發明為了解決現有技術中真菌tef1的簡并引物擴增時存在較多非特異擴增，且相應的擴增產物在后續測序時經常性地因為產物內的連續A堿基序列導致測序失敗的技術問題，公開了以下技術方案：

本發明公開了一種木霉屬真菌tef1分子標記基因保守區域，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述SEQ ID NO.1為第四外顯子3’端，核苷酸序列為： 5’-RYRACAGCCAYGTSGACTCCGGMAAGTCKACCACCGTRAGT-3’，SEQ ID NO.2為第六外顯子5’端：5’-AGACGCYCCCGGYCACCGTGAYTTCATCAAGAACATGATCACTGGTAC-3’；其中R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G，M＝A/C，K＝G/T。

本發明還公開了一種簡并引物組，包括序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述SEQID NO.3為正向引物，核苷酸序列為：5’-RYRACAGCCAYGTSGACTC-3’；所述SEQ ID NO.4為反向引物，核苷酸序列為：5’ -GARGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3’；其中，R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G；