[發明專利]一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011456823.7
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112553238B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 葉偉;章衛民;徐詩航;李賽妮;陳書帥;劉昭明;張維陽;許麗瓊
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66;C12R1/645
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發明公開了一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用。本發明首次利用啟動子優化后的新型CRISPR/Cas9系統構建二萜類新骨架化合物生物合成基因被敲除的重組擬盾殼霉FS482菌株，建立了一種高效的適用于深海真菌擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除體系，從而為擬盾殼霉FS482新型活性次級代謝產物的生物合成機制的闡明以及獲得更多具有顯著生物學活性的新型次級代謝產物奠定分子生物學基礎。

技術領域

本發明屬于生物化學和分子生物學技術領域，具體涉及一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用。

背景技術

深海真菌Paraconiothyrium hawaiiense FS482是一種來源于深海的擬盾殼霉，該真菌能產生具有抑制血管緊張素轉化酶的新骨架二萜類化合物，因此具有發掘抗高血壓類藥物先導化合物的潛力。在此基礎上，對P. hawaiiense FS482進行了基因組測序，預測了新骨架化合物的生物合成基因簇。預測該化合物由含有萜類環化酶、P450單加氧酶和甲基轉移酶的cluster 66生物合成，P450單加氧酶對其骨架的形成及修飾都發揮重要功能。因此有必要對P450進行缺失以驗證其在二萜類新骨架化合物生物合成過程中的功能。但是目前深海真菌P. hawaiiense FS482基因敲除體系尚未成功建立，限制了其活性次級代謝產物生物合成機制解析。因此，本發明將首次建立深海真菌P. hawaiiense FS482的基因敲除體系，從而為活性次級代謝產物生物合成機制的解析及通過合成生物學策略獲得得更多新型衍生物奠定基礎。

CRISPR/Cas9是一種由sgRNA介導Cas9核酸酶對靶向基因進行切割的基因編輯技術。通過對Cas9的突變及融合可使CRISPR/Cas9系統廣泛應用于目的基因的轉錄激活、甲基化修飾和單堿基突變等。CRISPR/Cas9系統由于構建簡單、基因敲除效率相對較高、可控性強、成本較低等優點已經在哺乳動物細胞、干細胞、酵母、細菌的基因組編輯方面有著十分廣泛的應用，而由于深海真菌獨特生境導致的相對復雜的遺傳背景，且CRISPR/Cas9系統在絲狀真菌中敲除效率相對較低。

發明內容

本發明的目的在于克服目前深海真菌缺乏有效的遺傳操作手段的現狀，提供一種適用于擬盾殼霉FS482（Paraconiothyrium hawaiiense FS482）的CRISPR/Cas9載體及其構建方法和應用。

本發明首次將優化后的CRISPR/Cas9系統應用于深海真菌擬盾殼霉目的基因的敲除。

本發明的第一個目的是提供一種適用于絲狀真菌的CRISPR/Cas9基因敲除載體，其是通過以下步驟制備得到的：

a. 采用限制性內切酶PacI 對pFC332載體進行酶切，對酶切后的pFC332載體進行回收；

b. 以pG-F: CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R: CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC為引物，以埃德菌FS110基因組DNA為模板，擴增并回收得到pG啟動子片段；

c. 將pG啟動子片段采用同源重組插入至酶切后的pFC332載體，菌液PCR和測序驗證pG啟動子的插入，構建得到pG-pFC332載體。

通過上述的構建方法，將pFC332載體中的原啟動子替換為轉錄活性更強的pG啟動子。

優選，所述的絲狀真菌為擬盾殼霉FS482。

本發明還提供一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體的構建方法，包括以下步驟：