[發(fā)明專利]一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011456823.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112553238B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉偉;章衛(wèi)民;徐詩(shī)航;李賽妮;陳書(shū)帥;劉昭明;張維陽(yáng);許麗瓊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測(cè)中心）
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/66;C12R1/645
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

1.一種適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.采用限制性內(nèi)切酶PacI對(duì)pFC332載體進(jìn)行酶切，對(duì)酶切后的pFC332載體進(jìn)行回收；

b.以 pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R:CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC 為引物，以埃德菌FS110基因組DNA為模板，擴(kuò)增并回收得到pG啟動(dòng)子片段；

c.將pG啟動(dòng)子片段采用同源重組插入至酶切后的pFC332載體，菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證pG啟動(dòng)子的插入，構(gòu)建得到pG-pFC332載體；

d.在所述的pG-pFC332載體的基礎(chǔ)上，以P450基因的靶點(diǎn)序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3'，設(shè)計(jì)并擴(kuò)增5SrRNA片段和含靶點(diǎn)序列的sgRNA片段，然后以5SrRNA片段和含靶點(diǎn)序列的sgRNA片段為模板，進(jìn)行融合PCR得到5SrRNA-P450-sgRNA片段；

e.用限制性內(nèi)切酶PacI和BglII雙酶切pG-pFC332載體、5SrRNA-P450-sgRNA片段，然后用T4 DNA連接酶將5SrRNA-P450-sgRNA片段連接至pG-pFC332載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp抗性篩選，擴(kuò)增5SrRNA-P450-sgRNA片段進(jìn)行驗(yàn)證，由此獲得適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體；

所述的絲狀真菌為擬盾殼霉FS482，所述的5SrRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的含靶點(diǎn)序列的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.按照權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體。

3.一種CRISPR/Cas9載體應(yīng)用于擬盾殼霉FS482中P450基因敲除的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入擬盾殼霉FS482原生質(zhì)體中，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，以擬盾殼霉FS482基因組為模板擴(kuò)增P450基因的上下游同源臂，然后進(jìn)行融合PCR，得到含有P450基因的上下游同源臂的基因片段；通過(guò)PEG介導(dǎo)法將所述的適用于擬盾殼霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除載體和所述基因片段導(dǎo)入擬盾殼霉FS482原生質(zhì)體，用潮霉素抗性PDA平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取基因組DNA驗(yàn)證重組載體的導(dǎo)入，并通過(guò)同源臂兩端引物驗(yàn)證目標(biāo)基因的敲除。