[發明專利]黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法

在審

• 申請號: 202011453366.6
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112553312A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 黃飛燕;余磊;葉賢文;柯艷果;方宇;王啟宇;吳治興;呂怡穎;趙婭紅;薛至勤
• 申請（專利權）人: 昆明學院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B20/30;G06Q10/04
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 牛林濤

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法。其通過制備黑脛病生理小種孢子懸浮液，并將該黑脛病生理小種孢子懸浮液人工注射于煙草莖基部獲得檢測樣品，對黑脛病菌脅迫響應miRNA進行檢測，通過構建降解組文庫測序分析，獲得靶基因預測數據。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法。

背景技術

由煙草疫霉菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起煙草黑脛病是我國煙草主要病害。據不完全統計，每年該病害都對我國烤煙生產造成了巨大的經濟損失。明確煙草抗黑脛病菌分子機理，培育抗黑脛病煙草品種是控制煙草黑脛病危害最經濟有效的手段。植物與病原菌互作的分子機制包括轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平等多方面調控機制。miRNA是一類堿基長度在20～25nt之間的內源性非編碼RNA，通過與靶基因結合，指導剪切或抑制靶基因翻譯，在轉錄后水平調控目標基因表達，參與調控植物生長發育各個方面以及逆境脅迫響應等生物學過程。研究表明，miRNA在抗病響應和感病響應中發揮重要作用，miRNA393是第一個被發現響應植物免疫系統的miRNA，它通過負調控靶基因生長素受體蛋白(TIR1和AFBs)表達，抑制生長素信號傳遞，進而促進由病原菌相關分子模式(PAMP)誘導的免疫反應(PTI)，也可通過調控PR1表達，促進效應子誘發的免疫(ETI)。另外，幾個植物miRNA，如miR160、miR167、miR398和miRNA1885，參與調控植物與病原菌親和互作和非親和互作。

隨著高通量測序技術的發展，降解組測序根據植物miRNA與靶基因幾乎完全配對調控靶基因表達特點，可準確確定靶基因mRNA的降解位點，從而鑒定miRNA靶基因，是結合了高通量測序、生物信息學分析和RACE驗證各種優勢的新的靶基因檢測方法。目前，國內外應用降解組測序技術篩選與驗證植物病原菌脅迫響應中miRNA靶基因工作未見報道。

發明內容

本發明的目的是要提供黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法。

為了解決上述技術問題，本發明采取的技術方案如下：

黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其具體包括以下步驟：

(1)制備燕麥培養基；

(2)制備黑脛病生理小種孢子懸浮液；

(3)制備煙草莖部樣品；

(4)檢測黑脛病菌脅迫下煙草miRNA；

(5)構建小RNA測序文庫，對測序文庫中的數據進行統計，判斷顯著性差異，并運用OmicShare工具進行熱圖聚類分析；

(6)構建降解組文庫，測序，并對測序數據進行分析；

(7)使用BLAST軟件對潛在miRNA靶基因序列進行GO功能注釋和代謝通路富集分析；

(8)根據small RNA高通量測序和生物信息學結果進行聯合分析，篩選響應黑脛病菌脅迫的關鍵代謝通路，從中篩選重要病程相關的miRNA及靶基因，分別進行qRT-PCR技術驗證。

上述的黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其所述的燕麥培養基的組份按重量百分數計，包括：燕麥片30g，瓊脂粉15g，去離子水1000ml。

上述的黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其所述黑脛病生理小種孢子懸浮液采用以下步驟制備：

(1)將分離純化的煙草黑脛病生理小種在燕麥培養基上培養21d，得到菌絲；