[發明專利]黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法在審
| 申請號： | 202011453366.6 | 申請日： | 2020-12-11 |
| 公開（公告）號： | CN112553312A | 公開（公告）日： | 2021-03-26 |
| 發明（設計）人： | 黃飛燕;余磊;葉賢文;柯艷果;方宇;王啟宇;吳治興;呂怡穎;趙婭紅;薛至勤 | 申請（專利權）人： | 昆明學院 |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869;G16B20/30;G06Q10/04 |
| 代理公司： | 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210 | 代理人： | 牛林濤 |
| 地址： | 650000 云南*** | 國省代碼： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 病菌 脅迫 煙草 mirna 基因 預測 驗證 方法 | ||
1.黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其特征在于：具體包括以下步驟：
(1)制備燕麥培養基；
(2)制備黑脛病生理小種孢子懸浮液；
(3)制備煙草莖部樣品；
(4)檢測黑脛病菌脅迫下煙草miRNA；
(5)構建小RNA測序文庫，對測序文庫中的數據進行統計，判斷顯著性差異，并運用OmicShare工具進行熱圖聚類分析；
(6)構建降解組文庫，測序，并對測序數據進行分析；
(7)使用BLAST軟件對潛在miRNA靶基因序列進行GO功能注釋和代謝通路富集分析；
(8)根據small RNA高通量測序和生物信息學結果進行聯合分析，篩選響應黑脛病菌脅迫的關鍵代謝通路，從中篩選重要病程相關的miRNA及靶基因，分別進行qRT-PCR技術驗證。
2.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其特征在于：所述的燕麥培養基的組份按重量百分數計，包括：燕麥片30g，瓊脂粉15g，去離子水1000ml。
3.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其特征在于：所述黑脛病生理小種孢子懸浮液采用以下步驟制備：
(1)將分離純化的煙草黑脛病生理小種在燕麥培養基上培養21d，得到菌絲；
(2)用0.1％KNO3和1％葡萄糖混合液浸泡所述菌絲，并放入26℃恒溫箱培養72h，再將其置于8℃冰箱中處理20min取出，室溫下10～30min有大量游動孢子釋放，過濾，鏡檢，調整游動孢子的濃度為1×103～1×104個/ml。
4.根據權利要求1所述的黑脛病菌脅迫下煙草miRNA靶基因預測及驗證方法，其特征在于：所述煙草莖部樣品采用以下步驟處理獲得：
(1)將煙草種子依次進行75％乙醇45s、5％次氯酸鈉8min浸泡和無菌水沖洗處理；
(2)播種于育苗棚漂浮盤中，育苗基質采用高溫高濕滅菌處理；
(3)待煙草長至8～10片真葉期時，轉入晝夜溫度分別為30℃和25℃、光暗時間比為12/8，濕度≥70％的人工氣候箱中，適應性培養7d；
(4)采用人工莖基部注射接種黑脛病生理小種孢子懸浮液，每株接種5ml，取莖基部以上1cm組織樣品1g，對所取樣品進行無菌水清洗，然后滅菌紙檫干，迅速用液氮冷凍樣品并將其放入-80℃超低溫冰箱保存，完成煙草莖部樣品的制備。
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