[發明專利]一種重組釀酒酵母及其應用

在審

• 申請號: 202011451952.7
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112553099A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 諸葛斌;任全路;賀亞曦;陸信曜;宗紅;馬騰飛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P5/00;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種重組釀酒酵母及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明首先構建了一株可以產蒎烯的菌株，通過基因操作同時敲除YPL062W和BTS1之后，菌株的生物量增加明顯，對蒎烯的生物合成具有積極的作用，并通過融合表達蒎烯合酶基因Pt1和ERG20ww，使單位菌體產量達到最高1.15mg/L*OD。

技術領域

本發明涉及一種重組釀酒酵母及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

蒎烯是一種天然活性單萜烯，廣泛用作調味劑、化學品和醫藥，特別是蒎烯二聚體可作為噴氣燃料替代品的良好候選者，也是一種耐高溫潤滑劑。目前，在工業上大量獲取蒎烯的方法還是利用高效精餾塔從脂松節油或粗硫酸鹽松節油中進行分離提取。這類傳統的獲取蒎烯的方法存在著效率低、操作復雜繁瑣、能源消耗大和設備技術要求高等缺點，同時破壞環境、消耗大量自然資源。因此，蒎烯的生物技術生產受到越來越多的關注。

釀酒酵母在生產萜類物質具有得天獨厚的優勢，酵母細胞在細胞色素P450酶的功能性表達方面比原核宿主具有優勢，而細胞色素P450酶是合成更復雜的單萜類化合物所必需的。有文獻報道釀酒酵母在生產倍半萜和多萜時的產量要高于大腸桿菌，證明了釀酒酵母更大的生產前景。到目前為止，雖然使用細菌宿主時,單萜生物生產更有效率。然而，在細菌底盤中設計單萜生物合成的下游步驟是具有挑戰性的，因為其中幾個步驟需要細胞色素p450酶的功能性表達，而這在細菌中是不容易實現的。但是到目前為止,低的單蒎烯產量阻礙了酵母細胞工廠有效的p450的進一步反應，并且現有的產率過低，導致生物法生產蒎烯在工業上的應用受限，所以實現釀酒酵母更高的蒎烯產量及更高的產率具有極大的意義。

發明內容

為了得到一種提高重組釀酒酵母生物量、蒎烯產量及催化效率的方法，本發明首先提供一種重組釀酒酵母，所述重組釀酒酵母強化表達了tHMG1，ERG20ww和IDI基因，敲除了YPL062W和BTS1基因，并融合表達了蒎烯合酶tPt1和ERG20ww。

所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基礎上，將第96位的苯丙氨酸和第127位的天冬氨酸突變得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述ERG20ww是在核氨酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基礎上，將第96位的苯丙氨酸突變為色氨酸，且將第127位的天冬氨酸突變為色氨酸得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述融合表達為通過linker進行融合表達，所述linker序列為GSGSGSGS。

在本發明的一種實施方式中，所述蒎烯合酶tPt1來自火炬松，其為蒎烯合酶基因Pt的截短序列；所述蒎烯合酶tPt1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述蒎烯合酶tPt1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本發明的一種實施方式中，本發明提供的來自火炬松的蒎烯合酶基因Pt1由蘇州金唯智公司合成，過表達來自火炬松的截短的tPt1，多拷貝位點整合過表達了釀酒酵母MVA通路的限制酶基因tHMG1、IDI和ERG20的突變體ERG20ww(F96W/N127W)，并通過敲除YPL062W和BTS1，以及融合表達ERG20ww和tPt1實現蒎烯的生產提高。

在本發明的一種實施方式中，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本發明的一種實施方式中，所述ERG20ww的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本發明的一種實施方式中，所述tHMG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本發明的一種實施方式中，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本發明的一種實施方式中，所述IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在本發明的一種實施方式中，所述IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。