[發明專利]一種重組釀酒酵母及其應用

在審

• 申請號: 202011451952.7
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112553099A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 諸葛斌;任全路;賀亞曦;陸信曜;宗紅;馬騰飛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P5/00;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種重組釀酒酵母，其特征在于，強化表達了tHMG1，ERG20ww和IDI基因，敲除了YPL062W和BTS1基因，并融合表達了蒎烯合酶tPt1和ERG20ww；

所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基礎上，將第96位的苯丙氨酸和第127位的天冬氨酸突變得到的。

2.如權利要求1所述的一種重組釀酒酵母，其特征在于，所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基礎上，將第96位的苯丙氨酸突變為色氨酸，并將第127位的天冬氨酸突變為色氨酸得到的。

3.如權利要求2所述的一種重組釀酒酵母，其特征在于，所述融合表達是將蒎烯合酶tPt1和ERG20ww通過linker融合連接后表達，所述linker序列為GSGSGSGS。

4.如權利要求1-3任一所述的一種重組釀酒酵母，其特征在于，所述蒎烯合酶tPt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；優選的，所述tHMG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；優選的，所述IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.如權利要求1-4任一所述的一種重組釀酒酵母，其特征在于，所述YPL062W的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；優選的，所述BTS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.如權利要求1-5任一所述的一種重組釀酒酵母，其特征在于，以S.cerevisiae w303或S.cerevisiae CEN.PK2-1C為宿主細胞。

7.一種構建權利要求1-6任一所述的重組釀酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)化學合成蒎烯合酶基因，并將蒎烯合酶基因連接到質粒上，得到重組質粒；

(2)將編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ERG20ww的基因，編碼核苷酸序列如SEQID NO.9所示的tHMG1的基因和編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的IDI的基因通過同源重組的方法整合到釀酒酵母多拷貝整合位點德爾塔位點如SEQ ID NO.14所示，同時通過同源重組的方法將釀酒酵母染色體上的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示YPL062W的基因和編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示BTS1的基因的敲除，得到表達宿主；

(3)將步驟(1)得到重組質粒轉入步驟(2)得到的表達宿主中，構建得到重組釀酒酵母。

8.一種合成蒎烯的方法，其特征在于，將權利要求1-6任一所述的重組釀酒酵母添加至培養基中培養，得到種子液，再將種子液接種至培養基中，發酵制備蒎烯。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述發酵是在30℃，200rpm條件下發酵10-12h后，添加十二烷，接著搖瓶發酵70-120h。

10.權利要求1-6任一所述的重組釀酒酵母，或權利要求8或9所述的方法在制備含有蒎烯的產品中的應用。