[發明專利]一種催化效率高的制備(-)γ-內酰胺的方法

有效

• 申請號: 202011449267.0
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112481320B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 倪曄;周彤彤;許國超;韓瑞枝;周婕妤;董晉軍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/02;C12N9/86;C12P41/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種催化效率高的制備(?)γ?內酰胺的方法應用，屬于生物工程技術領域。本發明的(+)γ?內酰胺酶來源于嗜熱菌(Thermaerobacter marianensis)DSM 12885，可作為催化劑用于制備光學純(?)?γ?內酰胺。其底物耐受濃度高、催化活性高、穩定性好、立體選擇性強、適用的反應條件溫和、對環境友好，具有很好的應用開發前景。

技術領域

本發明涉及一種催化效率高的制備(-)γ-內酰胺的方法，屬于生物工程及酶工程技術領域。

背景技術

γ-內酰胺作為一種重要的手性化合物，可以被用來合成抗病毒藥物阿巴卡韋、帕拉米韋，還可以用于合成神經酰胺酶抑制劑，在醫藥化學領域的應用引起廣泛關注。

γ-內酰胺酶作用于酰胺鍵，而非蛋白質肽鍵，并形成羧酸。具有立體選擇性的γ-內酰胺酶可以不對稱水解γ-內酰胺獲得光學純的γ-內酰胺。

(-)γ-內酰胺最初的生產工藝是利用堿性蛋白酶在水/四氫呋喃的混合溶劑中對外消旋γ-內酰胺選擇性水解，底物濃度可達100g/L。1996年Nakano hiroto等人，利用脂肪酶拆分水解外消旋γ-內酰胺(Nakano hiroto et al.Tetrahedron：Asymmetry，1996，7(8)：2381-2386)。1999年，Mahmoudian等以N-乙酰基-L-苯丙氨酸為唯一碳源篩選得到了來源于假單胞菌屬產生的(+)γ-內酰胺酶，該酶能夠高立體選擇性的拆分外消旋γ-內酰胺，但穩定性差，易喪失活性，無法對酶的性質進行表征(Mahmoudian et al.Tetrahedron：Asymmetry，1999，10(6)：1201-1206)。2000年，Wisdom等人報道篩選到一株是食酸毛單胞菌，該酶較以往鑒定的酶具有更高的穩定性，能在較高底物濃度下進行拆分反應(Microorganism，lactamase enzyme obtained therefrom,and their use，2000，UnitedStates patent,US006090616A)；但是野生菌遺傳背景復雜，發酵成本高，且γ-內酰胺酶表達量有限，在全細胞催化文斯內酯拆分反應時需要添加大量細胞，限制了其在工業上的應用。2015年，鄭等人發現了來源嗜熱古菌的(+)γ-內酰胺酶，其最適反應溫度超過100℃(Zheng G et al.Appl Biochem Biotechnol，2015，176:170–184.)，然而過高的最適溫度使反應條件更為嚴苛，違背工業生產要求。近年來，隨著海量基因組數據的公開，從數據庫中挖掘具有優越性能的新的γ-內酰胺酶成為熱點研究。實現γ-內酰胺酶合適的穩定、高效、可溶表達，并應用于立體選擇性拆分外消旋γ-內酰胺，是工業化制備光學純(-)γ-內酰胺的潛在方法。

由于大腸桿菌表達系統的優勢，成為在工業上應用比較廣泛的生產菌株，發明人課題組前期嘗試將代爾夫特菌(Delftia acidovorans)來源的γ-內酰胺酶在大腸桿菌E.coli BL21中表達，但是其可溶性差，幾乎以包涵體形式存在，限制了在拆分文斯內酯反應中的應用。因此，如何得到一種穩定、高效、可溶表達的γ-內酰胺酶以高效催化制備光學純(-)γ-內酰胺成為研究的熱點和難點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對已經報道的(+)γ-內酰胺酶的對底物文斯內酯的低催化效率，熱穩定性差等問題，提供通過基因工程表達得到一種穩定、高效、可溶表達的γ-內酰胺酶以高效催化制備光學純(-)γ-內酰胺的方法。

本發明首先提供了一種重組大腸桿菌，表達了來源于嗜熱菌(Thermaerobactermarianensis)DSM 12885的(+)γ-內酰胺酶。

在本發明的一種實施方式中，所述(+)γ-內酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述(+)γ-內酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。