[發(fā)明專利]一種提高紅掌轉(zhuǎn)化效率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011446651.5
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112522301B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉會君;程曼;馬志;范士猛
• 申請（專利權(quán)）人: 山東和正生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/53;C12N15/65;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/10
• 代理公司: 濟(jì)南千慧專利事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37232
• 代理人: 趙長林

1.一種提高紅掌轉(zhuǎn)化效率的方法，包括通過菌液將外源基因?qū)爰t掌的受體材料的過程，其特征在于：

包括如下步驟：受體材料準(zhǔn)備；菌液制備；外植體浸染；外植體共培養(yǎng)；轉(zhuǎn)化外植體洗菌；陽性篩選及熒光檢測；

所述受體材料來自于帶腋芽莖段；

所述菌液按照如下方法制備得到：用帶GFP基因的植物表達(dá)載體pBI 121，通過酶切連接菊花Flavanone 3-hydroxylase基因，然后使用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌，獲得帶植物表達(dá)載體pBI 121-GFP-Flavanone 3-hydroxylase的農(nóng)桿菌菌液；

吸取菌液，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量體積濃度比為50mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0. 8，然后離心10min收集菌體，再用 LB液體培養(yǎng)基重懸，振蕩培養(yǎng)，至菌液OD值為0.8-1.0，得到遺傳轉(zhuǎn)化浸染液，所述LB液體培養(yǎng)基含80-120mg/L 的AS；所述LB液體培養(yǎng)基包括如下組份：8-12g/L胰蛋白胨，4-6g/L酵母提取物，4-6g/L NaCl，pH值為7.2-7.8；

所述外植體浸染為將預(yù)培養(yǎng)一周的受體材料浸入到遺傳轉(zhuǎn)化浸染液中，讓外植體完全浸泡在浸染液中，密封在抽真空的條件下進(jìn)行浸染，真空度不低于0.08Mpa；

轉(zhuǎn)化外植體洗菌包括將外植體取出，放入滅菌的錐形瓶進(jìn)行洗菌，將外植體沖洗之后，再利用羧芐青霉素和頭孢霉素復(fù)合溶液進(jìn)行多次沖洗，所述羧芐青霉素和頭孢霉素的濃度按照沖洗的前后順序逐步降低，并且降低至與陽性篩選所用培養(yǎng)基一致的濃度；

沖洗過程如下：第一次，無菌水沖洗受體材料表面，直至受體材料表面無附著菌體；第二次，使用含有350-450mg/L 羧芐青霉素，350-400mg/L 頭孢霉素?zé)o菌水沖洗受體材料表面；第三次，使用含有250-350mg/L 羧芐青霉素，250-350mg/L 頭孢霉素的無菌水沖洗受體材料表面；第四次，使用150-250mg/L 羧芐青霉素，150-250mg/L 頭孢霉素的無菌水沖洗受體材料表面；第五次，使用50-100mg/L 羧芐青霉素，50-100mg/L 頭孢霉素?zé)o菌水沖洗受體材料表面；第一次沖洗2min，第二次沖洗5min，第三次沖洗10min，第四次沖洗15min，第五次沖洗20min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高紅掌轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于：所述受體材料按照如下方法得到：選擇20-25d的無菌紅掌幼苗，切取帶腋芽莖段預(yù)培養(yǎng)為受體材料；所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間不少于2天。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高紅掌轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于：將浸染后的外植體從遺傳轉(zhuǎn)化浸染液中取出，使用無菌濾紙吸干外植體表面農(nóng)桿菌，風(fēng)機(jī)吹至表面 無明顯菌液，然后轉(zhuǎn)移到含80-120mg/L的 AS的1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，在黑暗條件下共培養(yǎng)不少于3d；所述1/2 MS培養(yǎng)基還包括0.8-1.2mg/L的 6-BA，0.8-1.2mg/L的 ZT，0.2-0.4 mg/L的 IBA，15-25g/L的蔗糖，5-6g/L瓊脂，pH 5. 2-5. 4。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高紅掌轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于：陽性篩選包括將洗菌后的外植體，先轉(zhuǎn)移到濃度為50-100mg/L卡那霉素、50-100mg/L頭孢霉素和50-100mg/L羧芐青霉素的固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在23-27°C、光周期為10-12h/d的條件下培養(yǎng)不少于10d；然后轉(zhuǎn)接至濃度為50mg/L卡那霉素、50mg/L頭孢霉素和50mg/L羧芐青霉素的固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在23-27°C、光周期為10-12h/d的條件下培養(yǎng)不少于15d；接著轉(zhuǎn)接至濃度為50mg/L卡那霉素、50mg/L頭孢霉素和50mg/L羧芐青霉素的固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在23-27°C、光周期為10h/d的條件下繼續(xù)培養(yǎng)；所述固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，還包括1. 0mg/L的 6-BA，1. 0mg/L的 ZT，0. 3 mg/L的 IBA，20g/L的蔗糖，5. 5g/L的瓊脂，pH 5. 2 - 5. 4；熒光檢測包括在激發(fā)光450-490nm藍(lán)光波長照射下，陽性受體材料可激發(fā)出綠色熒光，使用體式熒光顯微鏡對受體材料進(jìn)行檢測，初步篩選陽性植物。