[發明專利]基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011444070.8
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112578126A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 胡文君;劉鋼;許浩;黃麗萍
• 申請（專利權）人: 量準（上海）醫療器械有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 北京金蓄專利代理有限公司 11544
• 代理人: 洪濤

本發明公開了一種基于等離子共振的尿液D?二聚體定量檢測方法，包括：準備無底孔板，制備納米光學傳感器芯片，用于產生等離光子諧振耦合效應的設備；制備納米金顆粒，用于放大檢測信號；配制D?二聚體濃度標準樣品，用于測量樣品中的D?二聚體濃度；配置反應緩沖液試劑作為第一試劑，然后用D?二聚體標記抗體標記納米金顆粒，制成第二試劑；向第一試劑中加入D?二聚體標準尿液樣品或尿液待測樣品，制備成混合溶液并加入到多孔微孔板中；加入第二試劑，完成D?二聚體與標記納米金顆粒復合物的捕獲；通過檢測加入第二試劑前后580nm波長下的OD差值，實現D?二聚體定量檢測。

技術領域

本發明實施例涉及檢測技術領域，以D-二聚體(D-Dimer)為例利用 酶標儀及納米金顆粒來進行定量檢測的方法。

背景技術

分子相互作用動力學的測量在藥物發現，遺傳篩查和臨床診斷中越來 越重要，因為動態結合信息可以提高對疾病的認識和可以為治療提供新思 路。表面等離子體共振(SPR)傳感器，如商業Biacore SPR生物傳感器系 統，能夠實時監測動力學生物分子相互作用，無需標記，不受大量背景的 影響。由于商業Biacore SPR生物傳感器系統屬于傳統SPR設備，所以其 需要特制的設備，專人的操作，使得購買或使用該生物傳感器系統需要大 量的金錢。

以D-二聚體作為示例蛋白是D-二聚體來源于纖溶酶溶解的交聯纖維 蛋白凝塊，主要反映纖維蛋白溶解功能。D-二聚體的臨床檢測主要應用在 靜脈血栓栓塞(VTE)、深靜脈血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的診斷。 血液中有纖維蛋白，纖維蛋白經過活化和水解，產生特異的降解產物稱為 “纖維蛋白降解產物。D-二聚體是最簡單的纖維蛋白降解產物，D-二聚體 水平升高說明體內存在高凝狀態和繼發性的纖維蛋白溶解亢進。尿中D- 二聚體濃度升高，除以上疾病外，還可以提示感染如腎小球腎炎或膀胱腫 瘤等。因此，D-二聚體質量濃度對血栓性疾病以及泌尿系統疾病的診斷、 療效評估和預后判斷具有重要的意義。

然而，現有的含量測定方法要么成本較高，要么精度不夠高，或者測 定操作復雜。由此，希望能夠提供一種操作簡單且精度高的低成本方案。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種以D-二聚體為例利用酶標儀及納米金顆 粒來進行定量檢測的方法，以解決現有技術中存在上述缺陷，提供一種操 作簡單且精度高、成本低的基于等離子共振的D-二聚體定量檢測方法。

一種以D-二聚體(D-Dimer)為例利用酶標儀、nanoSPR芯片以及納 米金顆粒來進行定量檢測的方法，所述方法包括以下步驟：自制打印無底 孔板(例如96孔板)，制備納米光學傳感器芯片(PORT芯片)，用于產生 等離光子諧振耦合效應的設備；制備納米金顆粒，用于放大檢測信號；配 置反應緩沖液試劑作為第一試劑，然后用D-二聚體標記抗體標記納米金顆 粒，制成第二試劑；向第一試劑中加入D-二聚體標準尿液樣品或尿液待測 樣品，制備成混合溶液并加入到多孔微孔板中；加入第二試劑，完成D- 二聚體與標記納米金顆粒復合物的捕獲；通過檢測加入第二試劑前后 580nm波長下的OD差值，實現D-二聚體定量檢測。

具體優選地，制備納米光學傳感器芯片采用復制成形工藝。

具體優選地，制備納米光學傳感器芯片方法如下，利用激光干涉光刻 在石英基板上制作錐形納米柱圖案，然后將紫外光固化聚合物(NOA-61， Sigma)均勻散布在模具上，頂部以聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)支撐； 用紫外光進行3分鐘固化處理，然后將聚對苯二甲酸乙二醇酯基板連同周 期性納米孔道圖案從模具上仔細剝除；通過電子束蒸發沉積形成一個鈦 (Ti)粘附層和一個黃金層，以實現等離激元器件成形，然后利用射頻等 離子體濺射沉積二氧化鈦諧振腔層，而后通過16nm鈦粘附層和頂部黃金 層的電子束蒸發形成納米諧振腔。

具體優選地，所述鈦黏附層、黃金層和二氧化鈦諧振腔層的厚度分別 是16nm、220nm和180nm。

具體優選地，制備粒徑為13～15nm納米金顆粒。