[發明專利]基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011444070.8
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112578126A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 胡文君;劉鋼;許浩;黃麗萍
• 申請（專利權）人: 量準（上海）醫療器械有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 北京金蓄專利代理有限公司 11544
• 代理人: 洪濤

1.一種基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

第一步驟：準備無底孔板以及納米光學傳感器芯片；

第二步驟：制備納米金顆粒，用于放大檢測信號；

第三步驟：配制D-二聚體濃度標準樣品，用于測量樣品中的D-二聚體濃度；

第四步驟：配置反應緩沖液試劑作為第一試劑，然后用D-二聚體標記抗體標記納米金顆粒，制成第二試劑；

第五步驟：向第一試劑中加入D-二聚體標準尿液樣品或尿液待測樣品，制備成混合溶液并加入到多孔微孔板中，其中多孔微孔板中配置有納米光學傳感器芯片；

第六步驟：向中多孔微孔板加入第二試劑，完成D-二聚體與標記納米金顆粒復合物的捕獲；

第七步驟：通過檢測加入第二試劑前后580nm波長下的OD差值，實現D-二聚體定量檢測。

2.根據權利要求1所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，制備納米光學傳感器芯片采用復制成形工藝，其中利用激光干涉光刻在石英基板上制作錐形納米柱圖案，然后將紫外光固化聚合物NOA-61均勻散布在模具上，頂部以聚對苯二甲酸乙二醇酯支撐；用紫外光進行3分鐘固化處理，然后將聚對苯二甲酸乙二醇酯基板連同周期性納米孔道圖案從模具上仔細剝除；通過電子束蒸發沉積形成一個鈦粘附層和一個黃金層，以實現等離激元器件成形，然后利用射頻等離子體濺射沉積二氧化鈦諧振腔層，而后通過16nm鈦粘附層和頂部黃金層的電子束蒸發形成納米諧振腔。

3.根據權利要求2所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，所述鈦黏附層、黃金層和二氧化鈦諧振腔層的厚度分別是16nm、220nm和180nm。

4.根據權利要求1所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，制備粒徑為13～15nm納米金顆粒。

5.根據權利要求4所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，制備納米金顆粒的方法如下，在100ml去離子水中加入1ml 1％氯金酸溶液，加熱至沸騰，然后再加入4mL 1％檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱并采用磁力攪拌器進行攪拌，溶液顏色會由黑色變至橙紅色，待溶液顏色恒定，再加熱15分鐘后停止加熱；靜置，冷卻至室溫，得到Au納米顆粒分散溶液，即最終的納米金顆粒。

6.根據權利要求1所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，納米光學傳感器芯片覆蓋D-二聚體捕獲抗體的方法如下，在室溫條件下將納米光學傳感器芯片置于1mM 11-巰基十一烷酸溶液中12小時，用70％乙醇清洗后以氮氣吹干；加入400×10-3M 1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和100×10-3M N-羥基丁二酰亞胺的1:1混合液中孵育30分鐘；孵育結束后立即放入50μg/ml單克隆抗D-二聚體捕獲抗體內于4度冰箱中孵育5小時，PBS清洗兩次后用氮氣吹干；加入30μg/ml牛血清白蛋白阻斷液中室溫孵育30分鐘，去除牛血清白蛋白阻斷液并加入10％乙醇胺溶液室溫孵育30分鐘，以覆蓋未反應的NHS酯；去離子水清洗后兩次后，氮氣吹干后放置于干燥環境中。

7.根據權利要求1所述的基于等離子共振的尿液D-二聚體定量檢測方法，其特征在于，配制D-二聚體濃度標準樣品的方法如下，采用2μg/ml的D-二聚體蛋白溶液為母液，稀釋配制為不同濃度梯度的D-二聚體標準樣品溶液(1ng/ml～500g/ml)；稀釋底液為PBS緩沖液；待測樣品為尿樣，將樣本進行2000g離心10分鐘后取上清，1：2或更高的比例稀釋后進行檢測，稀釋底液為PBS緩沖液。