[發(fā)明專利]一種高效獲得秈稻贛香B轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011442695.0
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112410372A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 熊文濤;沈雨民;陳明亮;肖葉青;羅世友;熊煥金;吳小燕
• 申請（專利權(quán)）人: 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 南昌市平凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 36122
• 代理人: 夏材祥

1.一種高效獲得秈稻贛香B轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的方法，包括受體材料的準(zhǔn)備、農(nóng)桿菌供體菌株培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、抗性愈傷組織的篩選、分化培養(yǎng)基及抗性植株的檢測步驟，其特征在于：

受體材料采用贛香B的種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)獲得胚性愈傷；

通過PCR擴(kuò)增和酶切方法，將目的基因連接到表達(dá)載體pCUbi1390，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a體內(nèi)，提取質(zhì)粒，然后通過電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105；

活化農(nóng)桿菌菌液濃度至OD₆₀₀=1.0，侵染愈傷組織時，等體積MS重懸農(nóng)桿菌菌液濃度至OD₆₀₀=0.3，MS重懸液中含有乙酰丁香酮濃度為150uM；

將重懸后的農(nóng)桿菌細(xì)胞浸入水稻愈傷組織，在調(diào)至50 rpm的搖床上緩和培養(yǎng)20-25min，用滅菌濾紙吸干愈傷組織上的多余菌液，之后將這些愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上，在27±1℃黑暗條件下共培養(yǎng)48 h，一旦愈傷組織出現(xiàn)了少量農(nóng)桿菌，用加入了250 mg/l頭孢噻肟無菌水清洗8-10次，過濾后再次用無菌水濾紙充分吸干；

滅菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中，27±1℃黑暗培養(yǎng)12天，經(jīng)過第一輪篩選培養(yǎng)后，挑選正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪培養(yǎng)，經(jīng)過10天的第二輪篩選培養(yǎng)，挑選新長出來的微小愈傷轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行第三輪篩選，在27±1℃黑暗培養(yǎng)5天；

將第三輪篩選培養(yǎng)基中長出顆粒狀的微小愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在27±1℃黑暗條件下培養(yǎng)7天；之后將愈傷轉(zhuǎn)移至新的分化培養(yǎng)基上，在27±1℃光照條件下培養(yǎng)4天，最后轉(zhuǎn)移分化出來的幼苗到生根培養(yǎng)基上，待幼苗生長茁壯根系較發(fā)達(dá)時進(jìn)行移栽煉苗；

提取每個植株的總DNA，采用PCR方法擴(kuò)增檢測植株內(nèi)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；如果電泳能夠檢測出目的條帶，表明外源基因整合到受體細(xì)胞的染色體中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效獲得秈稻贛香B轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于：贛香B胚性愈傷通過以下方法誘導(dǎo)獲得：取贛香B成熟種子，先用70%乙醇浸泡1 min,隨后用50% 次氯酸鈉處理30 min，在調(diào)至180 rpm的搖床上搖晃，用無菌水沖洗8-10次，最后將沖洗好的種子放到滅菌濾紙上晾干5 min；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中放入種子，放入27±1℃環(huán)境黑暗培；經(jīng)過14天的黑暗誘導(dǎo)，挑選胚性愈傷組織放入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中27±1℃環(huán)境黑暗繼代培養(yǎng)4天。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高效獲得秈稻贛香B轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中加入了6-BA2 .0mg/L、NAA 0 .3mg/L、蔗糖30g/L、植物凝膠0 .4g/L。