[發(fā)明專利]一種高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的方法

在審

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• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112410372A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設計）人: 熊文濤;沈雨民;陳明亮;肖葉青;羅世友;熊煥金;吳小燕
• 申請（專利權）人: 江西省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 南昌市平凡知識產(chǎn)權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

本發(fā)明公開了一種高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的方法，包括以下步驟：受體材料的準備、農(nóng)桿菌供體菌株培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、抗性愈傷組織的篩選、分化培養(yǎng)基及抗性植株的檢測。通過優(yōu)化農(nóng)桿菌轉化時的菌液濃度、侵染時間、侵染條件、共培養(yǎng)條件等影響因素，建立了贛香B農(nóng)桿菌介導轉化體系。提高了現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導秈稻品種的轉化效率，建立起了以胚性愈傷為受體材料的高效贛香B農(nóng)桿菌轉化體系。

技術領域

本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導轉化體系，特別是一種高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的方法。

背景技術

贛香B是本研究室利用03B、IR58025B、金23B、新露B、江農(nóng)早2號B等5個來源不同水稻保持系經(jīng)過復合雜交，育成的一個三系保持系。其莖稈粗壯，個體優(yōu)勢較強，主莖葉片數(shù)12-13,；成熟期功能葉生長旺盛，不易早衰，落色好；株型緊散適中，葉下禾，分蘗能力較強，根系發(fā)達，劍葉直立，大穗大粒，著粒較密，穗長約22 cm，平均每穗粒數(shù)150粒，千粒重28-29g,不易落粒，長寬比3.3，有香味；柱頭外露率較高，直鏈淀粉含量較高。

初步檢測到Pib、Pikm、Pi33、Pi5抗稻瘟基因，分別分布在第2、8、9、11號染色體上。檢測到有磷高效基因Pup1的功能標記。具早熟顯性，適宜配秈粳交組合，制種產(chǎn)量高。已有15個組合19次分別在在福建、海南、云南、四川、重慶、貴州、浙江和江西等多個省市通過省級審定：贛優(yōu)明占（瓊審稻2010012、閩審稻2011004、滇審稻2012017 、渝審稻2014004 ）、贛優(yōu)607（渝審稻2012007）、贛香優(yōu)702（川審稻2013017）、贛優(yōu)5359（黔審稻2013003）、贛優(yōu)810（閩審稻2014008、綠超稻201914 ）、贛香優(yōu)510 （川審稻2014018）、贛優(yōu)671（閩審稻2015003）、贛優(yōu)673（閩審稻2015010）、贛優(yōu)9141（浙審稻2015008）、贛優(yōu)676（閩審稻2016003 ）、贛優(yōu)157（瓊審稻2016006）、贛香優(yōu)858（贛審稻20170027 ）、贛香優(yōu)993（贛審稻20170024）、贛優(yōu)7076（滇審稻2017009）、贛優(yōu)9812（瓊審稻2017003，粵審稻20180025）。

我們先后通過構建贛香B近等基因導入系；構建成以保持系贛香B為輪回親本，東鄉(xiāng)野生稻為供體親本的滲入系群體BC2F8共180個株系，通過大田低溫篩選獲得兩個耐冷株系，后續(xù)通過對贛香B和耐冷株系在常溫和低溫下進行表達譜差異測序，分析比較他們之間的差異，找到相關的冷脅迫基因，了解其耐冷的分子調(diào)控機理。

為了驗證篩選到的冷脅迫基因的生物學功能，我們構建了這些基因的超量表達載體，然后轉入秈稻贛香B 胚性愈傷組織中。眾所周知，大部分秈稻的轉化效率極低，為了能夠更好的研究贛香B中相關基因的生物學功能，對于高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的研究很有必要。因品種不同利用農(nóng)桿菌進行不同植物遺傳轉化時，其具體的實施條件和方法也不盡相同。目前尚未有高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是要提供一種高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的方法，通過誘導培養(yǎng)贛香B的愈傷組織，以根癌農(nóng)桿菌為介導，通過優(yōu)化農(nóng)桿菌轉化時的菌液濃度、侵染時間、侵染條件、共培養(yǎng)條件等影響因素，建立了贛香B農(nóng)桿菌介導轉化體系，從而獲得贛香B轉基因植株。為以后研究贛香B中的功能基因提供有力技術支持。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一種高效獲得秈稻贛香B轉基因植株的農(nóng)桿菌介導轉化體系的方法，包括受體材料的準備、轉化載體的構建、農(nóng)桿菌供體菌株培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、抗性愈傷組織的篩選、分化培養(yǎng)基及抗性植株的檢測等步驟，其特征在于：

（1）受體材料采用贛香B的種子作為外植體誘導愈傷組織，并經(jīng)過誘導和繼代培養(yǎng)獲得胚性愈傷；