[發(fā)明專利]一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011442400.X
• 申請(qǐng)日: 2020-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN112961814A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈曉強(qiáng);劉亞茹;楊松源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/60;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/90;C12P7/54;C12P7/40;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明涉及一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法；通過敲除野生型E.coli MG1655中的ptsG和manZ基因使其緩慢代謝葡萄糖同時(shí)優(yōu)先利用木糖。通過敲除E.coli MG1655氧化磷酸過程中關(guān)鍵基因atpFH促進(jìn)乙酸合成。通過敲除E.coli MG1655的envR基因促進(jìn)E.coli分泌FFA到胞外?；蚯贸こ叹媚咎悄軌蚝铣砂ㄕ核帷⒄帷⒄了?、正壬酸、正癸酸和正十二酸等六種FFA，在M9培養(yǎng)基中，以20g/L木糖為單碳源，能夠合成5.5g/L乙酸和0.91g/L胞外FFA，與野生E.coli MG1655相比產(chǎn)量明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，屬于基因工程研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著社會(huì)的發(fā)展，能源需求、資源危機(jī)、糧食短缺等問題日益突出，促使人們尋找新型能源資源。地球上三分之一的陸地被植物覆蓋，形成了大量的木質(zhì)纖維素資源。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中半纖維素約占木質(zhì)纖維素總量的20％～35％，其水解產(chǎn)物主要為木糖，使得木糖成為自然界中僅次于葡萄糖的第二多的糖類物質(zhì)。在半纖維素水解研究愈發(fā)深入的基礎(chǔ)上，木糖在農(nóng)業(yè)、工業(yè)甚至科研中的應(yīng)用也越來越廣泛。

大腸桿菌(E.coli)是目前已被廣泛研究的模式菌種之一，其基因背景清晰，遺傳改造手段豐富，應(yīng)被廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)研究。用于產(chǎn)生有價(jià)值化合物的重組菌株的優(yōu)化是基因工程的主要目標(biāo)。為此，已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種策略構(gòu)建重組菌株，包括增加代謝前體的供應(yīng)，缺失負(fù)調(diào)節(jié)劑，正調(diào)節(jié)劑的過表達(dá)以及去除前體消耗和產(chǎn)物降解途徑。乙酸是一種非常有前景的碳源，已被當(dāng)作有望降低PHA生產(chǎn)成本的底物之一。游離脂肪酸(free fattyacids，F(xiàn)FA)，是微生物利用脂肪酸合成通路中間代謝物Acyl-ACP為底物經(jīng)硫酯酶(thioesterases)催化合成的一種游離型脂肪酸。近十幾年間，理性代謝工程已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于提高FFA及其前體的合成，但目前偏好利用木糖高產(chǎn)乙酸和FFA的工程菌株的構(gòu)建還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明通過敲除E.coli MG1655中ptsG和manZ基因使其緩慢代謝葡萄糖同時(shí)優(yōu)先利用木糖。通過敲除E.coli MG1655氧化磷酸過程中關(guān)鍵基因atpFH促進(jìn)乙酸合成。驗(yàn)證敲除ptsG和manZ基因?qū).coli MG1655葡萄糖和木糖利用的影響。通過敲除E.coli MG1655的envR基因促進(jìn)大腸桿菌分泌FFA到胞外。最終獲得已敲除四個(gè)基因的工程菌ECΔp-m-a-e，進(jìn)行FFA和乙酸生產(chǎn)測(cè)試。

本發(fā)明具體技術(shù)如下：

一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法；通過敲除野生型E.coli MG1655中的ptsG和manZ基因使其緩慢代謝葡萄糖同時(shí)優(yōu)先利用木糖；通過敲除E.coli MG1655氧化磷酸過程中關(guān)鍵基因atpFH促進(jìn)乙酸合成；通過敲除E.coliMG1655的envR基因促進(jìn)大腸桿菌分泌FFA到胞外；其具體步驟如下：

(1)從E.coli MG1655中敲除ptsG基因得到菌株ECΔp；

(2)從菌株ECΔp中敲除manZ基因得到菌株ECΔp-m；

(3)從菌株ECΔp-m中敲除atpFH基因得到菌株ECΔp-m-a；

(4)從菌株ECΔp-m-a中敲除envR基因得到菌株ECΔp-m-a-e；

所述步驟(1)中ptsG基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述步驟(2)中manZ基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述步驟(3)中atpFH基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述步驟(4)中envR基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。