[發明專利]一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構建方法

在審

• 申請號: 202011442400.X
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112961814A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 賈曉強;劉亞茹;楊松源
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/90;C12P7/54;C12P7/40;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的大腸桿菌工程菌的構建方法；其特征是，包括如下步驟：

(1)從E.coli MG1655中敲除ptsG基因得到菌株ECΔp；

(2)從菌株ECΔp中敲除manZ基因得到菌株ECΔp-m；

(3)從菌株ECΔp-m中敲除atpFH基因得到菌株ECΔp-m-a；

(4)從菌株ECΔp-m-a中敲除envR基因得到菌株ECΔp-m-a-e。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是，ptsG基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1；manZ基因核苷酸序列為SEQ ID No.2；atpFH基因核苷酸序列為SEQ ID No.3；envR基因核苷酸序列為SEQ ID No.4。

3.如權利要求1所述的方法，其特征是，基因敲除是基于λ-red和I-SceI的基因組無痕操作技術；具體敲除步驟如下：

(1)以E.coli MG1655菌株基因組為模板，分別擴增出目的基因上下游同源臂片段A和片段B；

(2)以pTKS/CS質粒為模板，分別擴增四環素抗性基因tet上游片段tet1和下游片段tet2；

(3)再以片段A、tet1為模板，進行重疊延伸PCR擴增出片段A-tet1，同樣以片段tet2、B為模板，進行重疊延伸PCR擴增出片段tet2-B；

(4)再次進行重疊延伸PCR，以A-tet1和tet2-B為擴增模板，擴增出敲除片段A-t-B；

(5)敲除片段A-t-B經電擊轉化法轉入大腸桿菌；

(6)彈出四環素抗性及缺失pKTRed質粒，經兩次篩選后得到目的基因敲除菌株。

4.如權利要求3所述的方法，其特征是，pTKS/CS質粒為SEQ ID No.5所示核苷酸序列；四環素抗性基因tet為SEQ ID No.6所示核苷酸序列；上游片段tet1核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示；下游片段tet2基因核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；pKTRed質粒核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

5.如權利要求3所述的方法，其特征是，所述步驟1)中ptsG基因敲除引物序列如下：

ptsG-Af：TGGCTGTGTTGAAAGGTGTTGCCG

ptsG-Ar：TATCCCTAAGCACAATGCCTCTATTTAGTTAACGTTCTG

ptsG-Bf：AGGGTAATCAGAACGTTAACTAAATAGAGGCATTGTGCTAAAAACGAACAAATGGCAGAG

ptsG-Br：GTCTGCAAGGCGCTCAAGACG

ptsG-tetf1：CAGAACGTTAACTAAATAGAGGCATTGTGCTTAGGGATAACAGGGTAATATTTAC

ptsG-tetr1：GGTAAAGCGATCCCACCACCAGCC

ptsG-tetf2：GCGTGAAGTGGTTCGGTT

ptsG-tetr2：TCGTTTTTAGCACAATGCCTCTATTTAGTTAACGTTCTGATTACCCTGTTATCCCTAC。