[發明專利]基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數絕對定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011442259.3
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112359147A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 席玨敏;馬春霞;何忠煉
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

本發明涉及一種基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數絕對定量檢測方法，屬于基因技術領域。該方法通過構建ZIKV E標準品質粒，參照所得ZIKV E目的基因序列設計熒光定量PCR特異性引物，利用所得ZIKV E標準品質粒檢測培養上清中ZIKV E基因拷貝數。本發明是針對ZIKV E基因構建標準品質粒，即將ZIKV E基因全長構建到一個載體上，建立ZIKV熒光定量PCR絕對定量體系，該檢測體系的建立通過檢測ZIKV E基因，對ZIKV感染完成快速檢測，并對上清中ZIKV E基因拷貝數進行絕對定量，進而為ZIKV的防控供技術支持。

技術領域

本發明屬于基因技術領域，具體涉及一種基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數絕對定量檢測方法。

背景技術

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)屬于黃病毒科黃病毒屬，是經埃及伊蚊(A.aegypti)和白紋伊蚊(A.albopictus)等傳播的蟲媒病毒。寨卡病毒感染可引起胎兒小頭癥(Microcephaly)和嚴重的腦畸形等神經系統疾病，感染成年人可引起格林巴利綜合癥(Guillain-Barré syndrome)，導致腦炎、脊髓炎、以及與眼部感染相關的結膜炎、葡萄膜炎等。寨卡病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組含有約11000個核苷酸，含一個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼3個結構蛋白[衣殼蛋白(Capsid，C)，前膜(PrM)蛋白，包膜蛋白(Envelope，E)]和7個非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。根據基因組進化分析，可將寨卡病毒分為亞洲系和非洲系。

據WHO報道，全球已有84個國家和地區發現寨卡病毒的蟲媒傳播，13個地區報道了寨卡病毒的人際傳播，全球60多個國家和地區已經對寨卡病毒作出反應。WHO已經宣布寨卡病毒成為全球“緊急公共衛生事件(public health emergency)”。截至目前，北京、廣東、浙江等地均有輸入性寨卡病例報告，我國存在較大的輸入性病例風險，良好的檢測手段將有助于寨卡病毒的防控。目前，ZIKV的實驗室檢測方法主要包括病毒分離培養、血清學、核酸及生物傳感器檢測等。病毒分離培養要求高、耗時長，在血清學方面，黃病毒科成員之間存在交叉反應，新興的生物傳感器技術在檢測寨卡病毒靈敏度方面還需提高。

因此如何克服現有技術的不足是目前本技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種用于非治療和非診斷目的的基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數絕對定量檢測方法，可快速實現對寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量，為ZIKV的防控提供技術支持。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)ZIKV標準品質粒構建：

a.設計ZIKV E的PCR正、反向特異性引物：

ZIKV E For：5'-atcaggtgcataggagtcag-3'；

ZIKV E Rev：5'-agcagagacggctgtggataag-3'；

b.ZIKV的細胞培養：將寨卡病毒液接種Vero細胞上，培養至Vero細胞病變達80％以上時，收集培養上清液，離心取上清，即得病毒液；

c.陽性菌株的獲得：取病毒液提取ZIKV基因組RNA，逆轉錄獲得cDNA，然后利用步驟(1)a中的引物對進行擴增PCR，再將擴增產物連接到pMD-19T Vector克隆載體上，轉化Top10感受態細胞，挑單克隆進行測序鑒定，獲得ZIKV E目的基因序列鑒定正確的陽性菌株；