[發明專利]基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數絕對定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011442259.3
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112359147A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 席玨敏;馬春霞;何忠煉
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）ZIKV標準品質粒構建：

a．設計ZIKV E的PCR正、反向特異性引物：

ZIKV E For：5'-atcaggtgcataggagtcag-3'；

ZIKV E Rev：5'-agcagagacggctgtggataag-3'；

b. ZIKV的細胞培養：將寨卡病毒液接種Vero細胞上，培養至Vero細胞病變達80%以上時，收集培養上清液，離心取上清，即得病毒液；

c. 陽性菌株的獲得：取病毒液提取ZIKV基因組RNA，逆轉錄獲得cDNA，然后利用步驟（1）a中的引物對進行擴增PCR，再將擴增產物連接到pMD-19T Vector克隆載體上，轉化Top10感受態細胞，挑單克隆進行測序鑒定，獲得ZIKV E目的基因序列鑒定正確的陽性菌株；

d．標準品質粒的拷貝數計算：將步驟（1）c所得序列鑒定正確的陽性菌株轉入到氨芐抗性的LB液體培養基中，于37℃下，搖床中振蕩培養過夜，然后提取質粒，獲得ZIKV 標準品質粒，并用紫外分光光度計測定ZIKV標準品質粒的濃度，按下列公式計算標準品質粒的拷貝數：

Number of copies（copies/μl）=(Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）

其中，Amount為紫外分光光度計測得標準品質粒所測含量，單位ng/μl；Length代表模板DNA長度；

氨芐抗性的LB液體培養基為LB液體培養基+100μg/mL氨芐；

（2）設計下列熒光定量PCR特異性引物：

ZIKV E-1F：5'-gacagtcacagtggaggtacag-3'；

ZIKV E-1R：5'-cgactcctatgacaatgtaaga-3'；

（3）利用步驟（1）d所得ZIKV標準品質粒檢測待測培養上清中ZIKV E基因拷貝數，具體檢測方法如下：

a．將步驟（1）d所得ZIKV標準品質粒用雙蒸水按梯度稀釋，通過SYBR法采用步驟（2）的引物實時熒光定量PCR檢測獲得ZIKV標準品質粒的擴增曲線與溶解曲線，以熒光定量PCR檢測所得標準品Ct值作為X軸，標準品拷貝數log₁₀作為Y軸，繪制ZIKV標準品質粒的標準曲線，進而得到ZIKV標準品質粒的標準曲線方程；

b．采用步驟（3）a的相同的PCR反應體系，同時以SYBR法實時熒光定量PCR檢測待測培養上清中ZIKV E基因拷貝數，根據步驟（3）a利用標準品質粒得到標準曲線方程，進而獲得PCR檢測培養上清中ZIKV E基因的拷貝數。

2.根據權利要求1所述的基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量檢測方法，其特征在于，ZIKV的細胞培養的具體方法為：將寨卡病毒液接種到經無血清MEM溶液清洗過的Vero細胞上，先于溫度為37℃、CO₂體積濃度為5%的環境中恒溫吸附1小時，然后補加病毒維持液，于相同環境中培養至第4～5天，當Vero細胞病變達80%以上時，收集培養上清液，于4℃，12000×g離心30min，收獲上清，即得病毒液，-70℃凍存；

寨卡病毒液與病毒維持液的體積比為1：9；

所述的病毒維持液為MEM培養基+2%（w/v）胎牛血清。

3.根據權利要求2所述的基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量檢測方法，其特征在于，Vero細胞無血清MEM溶液清洗過2次。

4.根據權利要求1所述的基于寨卡病毒包膜基因的基因拷貝數的絕對定量檢測方法，其特征在于，陽性菌株的具體獲得方法為：取病毒液提取ZIKV基因組RNA，將ZIKV基因組RNA溶液先通過使用隨機引物進行逆轉錄，獲得cDNA，然后通過PCR的方法，利用步驟（1）a的特異性引物擴增ZIKV E基因，得到對應的擴增產物，再將擴增產物連接到pMD-19T Vector克隆載體上，轉化Top10感受態細胞，挑單克隆進行測序鑒定，獲得ZIKV E目的基因序列鑒定正確的陽性菌株。