[發(fā)明專利]新型溶菌酶熒光傳感器的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011437519.8
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112577937A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雅萍;陳欣然;張一沫;李紫燕;韓洪亮;張伊琳;武冰冰
• 申請（專利權(quán)）人: 首都師范大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C08F220/54;C08F222/38;C08F220/20;C08F220/06;C08F2/44;C08K3/04
• 代理公司: 北京冠榆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

本發(fā)明公開新型溶菌酶熒光傳感器的制備方法及其應(yīng)用，包括如下步驟：(1)碳量子點的制備及純化；(2)溶菌酶分子印跡聚合物的制備。本申請以CQDs為熒光信號，LYZ為模板分子，NIPAAM為溫敏單體，MAA、HEMA為輔助單體，MBA為交聯(lián)劑，APS為引發(fā)劑，以及TEMED為催化劑，合成了對模板分子LYZ有特異性識別能力的分子印跡水凝膠熒光傳感器。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及溶菌酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體地說是新型溶菌酶熒光傳感器的制備方法。

背景技術(shù)

溶菌酶(LYZ)是臨床診斷一些疾病的重要指標：結(jié)核性腦膜炎、神經(jīng)梅毒和真菌性腦膜炎患者的腦脊液中LYZ濃度會顯著升高；白血病和一些腎臟疾病患者的血清和尿液中LYZ活性也會發(fā)生變化。此外，LYZ還可以用作一些抗生素的有效替代品，甚至可以用于艾滋病等一些感染和潰瘍類疾病的治療。因此，在實際的生產(chǎn)生活中，將LYZ從實際生物樣品的復(fù)雜基質(zhì)中快速、有效且簡便地檢測出來是一件十分有意義的事情。現(xiàn)有較為常見的LYZ的檢測方法有：高效液相色譜法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫吸附法、紫外分光光度法、熒光探針法等。上述的方法普遍存在儀器成本高，要求樣品純凈，操作步驟繁瑣等缺點，并且實際檢測時樣品中難免存在高豐度蛋白等干擾物質(zhì)，極易影響上述方法的選擇性。因此，急需找到一種高選擇性、操作便捷、成本適中的檢測方法。

分子印跡技術(shù)是通過仿生原理對特定的分子進行檢測，因此，該技術(shù)具有優(yōu)良的特異識別性和靈敏性，尤其是在極為復(fù)雜的樣品中。分子印跡聚合物(MolecularlyImprinted Polymer,MIP)的合成一般需要三個步驟：首先，模板分子與功能單體通過共價鍵或非共價鍵作用進行組裝；接著加入引發(fā)劑，通過功能單體和交聯(lián)劑聚合，生成固定的高聚物體系；最后利用洗脫劑將模板分子從聚合物中洗脫出來，得到即與模板分子相匹配、具有多重作用點的空穴，進而在后續(xù)的檢測中可以對模板分子進行精準識別。在實際檢測中，MIP中的空穴會通過形狀匹配和官能團間的靜電作用(包括絡(luò)合作用)、氫鍵作用、疏水作用等相互作用，實現(xiàn)對模板分子的選擇性吸附。因此，可以形象的用“鎖鑰原理”來描述MIP的工作原理。

早在1972年，Wulff和Sarhan就發(fā)表了關(guān)于分子印跡的報道，分子印跡是現(xiàn)存的分子識別最常見的方法之一，它可以快速、靈敏和選擇性地識別和檢測目標分子。相比于自然界中的分子識別方法，分子印跡方法有低成本、高識別能力和長期耐用性等優(yōu)異的特點，并且應(yīng)用廣泛，可以用于色譜、載藥、固相萃取和傳感技術(shù)等領(lǐng)域。在實際研究和生產(chǎn)中，分子印跡技術(shù)已經(jīng)在多方面的得到應(yīng)用。在小分子印跡方面，Kochaporn Chullasat課題組利用分子印跡聚合物，構(gòu)建了一種光致發(fā)光探針，該方法重復(fù)性好，相對標準偏差小于6％，可以成功地用于實際樣品中阿莫西林的測定，回收率為85-102％，實現(xiàn)了對痕量阿莫西林的有效分析。同樣是抗生素分析，高敏君團隊成功制備了能夠特異性識別紅霉素的分子印跡二維光子晶體水凝膠，該方法具有高選擇性和可重復(fù)性的特點，有望用于紅霉素的低成本簡易檢測中。除了抗生素以外，MIP在人工染料的特異性檢測方面也表現(xiàn)出了非常優(yōu)異的潛力。蘇曉濛團隊通過將羅丹明B作為模板分子，成功制備了具有高特異性和識別能力的MIP，該方法可以作為固相萃取材料，回收率在78.47-101.6％之間，相對標準偏差2％，有望用于檢測食品中非法添加的羅丹明B。

從以上各例中不難看出，分子印跡技術(shù)應(yīng)用十分廣泛。但是傳統(tǒng)的分子印跡技術(shù)還存在著一些亟待解決的問題和不容忽視的缺陷：傳統(tǒng)分子印跡技術(shù)難免存在因吸附后檢測時需要離心、操作過程繁瑣復(fù)雜等缺點，而且MIP制備過程中所使用的模板分子一般以小分子化合物為主，而對于蛋白質(zhì)、病毒、細胞等生物大分子的印跡進展依然緩慢。此外，將分子印跡技術(shù)與在線熒光檢測結(jié)合，實現(xiàn)分子印跡的高選擇性和熒光檢測的高靈敏度兼顧成為現(xiàn)今分子印跡技術(shù)發(fā)展的重要趨勢，也是目前分子印跡技術(shù)研究的熱門領(lǐng)域。