[發(fā)明專利]一種基于點(diǎn)亮型RNA適體的CRISPR-Cas13核酸檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011436758.1
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112609010B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧銳杰;張婷
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6813;C12Q1/06;C12R1/085;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開了一種基于點(diǎn)亮型RNA適體的CRISPR?Cas13核酸檢測試劑盒，所述試劑盒包括：點(diǎn)亮型RNA適體、Cas13蛋白、crRNA和核酸染料；所述點(diǎn)亮型RNA適體可結(jié)合核酸染料并使其發(fā)射熒光，點(diǎn)亮型RNA適體如果被Cas13蛋白剪切，則熒光淬滅；所述crRNA為一段RNA，可與Cas13蛋白形成crRNA?Cas13復(fù)合物，當(dāng)Cas 13?crRNA結(jié)合靶標(biāo)RNA序列以后，激活Cas13蛋白的酶切活性，切除RNA適體。本發(fā)明的試劑盒可通過檢測RNA來檢測活病原體和RNA標(biāo)志物，相較于現(xiàn)有的基于CRISPR?Cas13的核酸檢測方法，該方法不依賴逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增，一步完成靶標(biāo)RNA序列檢測，檢測成本低，操作步驟簡單，且能保證較高的特異性和靈敏度，利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

由病原菌或者病毒引起地傳染疾病是威脅人類健康的最重要因素。此外，外周血核酸逐漸被公認(rèn)為包括癌癥在內(nèi)的分子標(biāo)志物，可以應(yīng)用于疾病的早期預(yù)警。近年來，對病原菌、病毒、疾病標(biāo)志物等生物體的分子檢測得到了廣泛的應(yīng)用，主要包括抗體檢測和核酸檢測。

由于抗體在血清免疫中的重要性，抗體檢測在分子檢測領(lǐng)域非常重要，例如，廣東康健生物科技醫(yī)藥公司的專利申請CN 111562370 A公開了一種基于膠體金的病毒抗體檢測方法，可獲得快速準(zhǔn)確的病毒檢測結(jié)果。然而，與基于蛋白質(zhì)的抗體相比，核酸具有化學(xué)穩(wěn)定性好、再生方便、儲(chǔ)存方便等優(yōu)點(diǎn)。并且，核酸檢測可以直接地，在病原菌感染、病毒感染或者腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)地早期檢測基因來確定是否感染或者患病。因此，核酸檢測技術(shù)分析已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。其中熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)是最強(qiáng)有力的定量工具。例如，2020年5月26日授權(quán)的專利CN 110982876 B采用qPCR擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了病毒的高效短時(shí)間檢測。此外，基于熒光，電化學(xué)和比色原理的DNA生物傳感器也得到了開發(fā)和應(yīng)用。通過分子探針(例如DNA，mRNA和rRNA)監(jiān)測生物體生存能力，對于生物體的核酸檢測至關(guān)重要。

但是，由于DNA可長期存在于生物體的任意生存狀態(tài)，并不能作為生物體活性鑒定的的理想指標(biāo)。相比較而言，RNA會(huì)隨著生物體的死亡在短時(shí)間內(nèi)降解，是生物體活性的標(biāo)志。目前也有大量學(xué)者構(gòu)建了一些節(jié)省時(shí)間和成本效益，可以通過RNA檢測來定量生物體的方法。但這些方法無法滿足同時(shí)具有高效率、高靈敏度、強(qiáng)特異性和低成本的需求。

CRISPR-Cas(聚簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列)是一類特殊的核酸蛋白復(fù)合體，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性。其中，在Cas蛋白中，Cas 13可以結(jié)合并切割RNA，是一種RNA導(dǎo)向酶。該切割過程需要CRISPR RNA(crRNA)的參與。crRNA是一種由錨定序列和向?qū)蛄薪M成的RNA，其向?qū)蛄胸?fù)責(zé)與特征單鏈RNA通過堿基互補(bǔ)配對相結(jié)合，形成雜交RNA，而錨定序列則可輔助前述雜交RNA進(jìn)入Cas13的特定結(jié)構(gòu)域，激活Cas13的酶切活性，進(jìn)而特征單鏈RNA被切割，切割后，Cas13會(huì)保持活性，對所處環(huán)境中的其他RNA分子進(jìn)行非特異性的切割，被稱作“旁切割(collateral cleavage)”。

Cas13a是Cas13家族中的一員。國家納米科學(xué)中心的專利申請CN 107557455A公開了一種核酸檢測方法，其利用CRISPR-Cas13的思路是：通過crRNA結(jié)合靶點(diǎn)RNA，激活CRISPR-Cas13復(fù)合體中Cas13a的酶切活性，會(huì)剪切檢測體系中添加的信號分子。該信號分子是預(yù)先加入的兩端分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的RNA，RNA被剪切后，熒光基團(tuán)就會(huì)發(fā)出熒光。該方法的靈敏度很高，可達(dá)到10^-18M。但是該靈敏度完全依賴對其模板提前進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(RPA)，提高模板量。目前RPA檢測的最低檢測限可達(dá)1拷貝(CN111593141A)。但是，CN107557455A的方法存在如下局限性：其信號分子制備需要在RNA的兩頭標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，同時(shí)在實(shí)際樣品檢測時(shí)需要提取RNA先逆轉(zhuǎn)錄成DNA再擴(kuò)增檢測，導(dǎo)致檢測成本極其昂貴，操作流程也十分復(fù)雜。