[發明專利]一種基于點亮型RNA適體的CRISPR-Cas13核酸檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202011436758.1
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112609010B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 鄧銳杰;張婷
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6813;C12Q1/06;C12R1/085;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種基于點亮型RNA適體的CRISPR-Cas13核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括：

（1）點亮型RNA適體或其DNA模板；所述點亮型RNA適體為Broccoli；

（2）Cas13蛋白；

（3）crRNA或其DNA模板；

（4）核酸染料；所述核酸染料為DFHBI-1T；

當試劑盒包括第（1）和/或第（3）項的DNA模板時，使用前需要將DNA模板轉錄成RNA；

所述點亮型RNA適體可特異性結合核酸染料并使其發射熒光，點亮型RNA適體如果被Cas13蛋白剪切，將無法與核酸染料結合，則熒光淬滅；

所述crRNA能與Cas13結合后形成Cas13-crRNA復合物，且形成Cas13-crRNA復合物后，在crRNA的向導序列與靶標RNA形成雙鏈的情況下能激活Cas13蛋白的酶切活性；

所述試劑盒是檢測蠟樣芽孢桿菌RNA的試劑盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

或，所述試劑盒是檢測沙門氏菌RNA的試劑盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示；

或，所述試劑盒是檢測大腸桿菌RNA的試劑盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述crRNA的錨定序列如SEQ ID NO.13所示。

3.一種定性檢測RNA樣本中靶標RNA的方法，其特征在于：所述方法為非診斷和治療目的，該方法包括如下步驟：

1）在RNA樣本中加入權利要求1或2所述試劑盒的點亮型RNA適體、核酸染料，檢測熒光；

2）加入權利要求1或2所述試劑盒的crRNA和Cas13蛋白的混合物；

3）檢測熒光；

當步驟3）檢測的熒光明顯弱于步驟1）的熒光，則表示檢測到了靶標RNA。

4.一種檢測RNA樣本中靶標RNA的含量的方法，其特征在于：所述方法為非診斷和治療目的，該方法包括如下步驟：

1）準備靶標RNA的標準品；

2）向標準品加入權利要求1 或2所述試劑盒的點亮型RNA適體、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激發光下檢測熒光，繪制標準曲線；

3）向RNA樣本中加入權利要求1或2所述試劑盒的點亮型RNA適體、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激發光下檢測熒光，代入標準曲線，得到靶標RNA濃度。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：所述crRNA與Cas13的摩爾比為（1:0.25）~（1：2）。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于：所述crRNA與Cas13的摩爾比為（1:0.25）~（1：1）。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于：所述crRNA與Cas13的摩爾比為1:1。