[發明專利]一種γ-谷氨酰轉肽酶檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 202011436205.6
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112608977B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 冷毅斌;王長樂;敖慧龍;王振平;陳冬琴
• 申請（專利權）人: 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 武漢世躍專利代理事務所(普通合伙) 42273
• 代理人: 倪婭

1.一種γ-谷氨酰轉肽酶檢測試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：基質緩沖液、酶提取液、底物、標準品和溶解稀釋液；

所述基質緩沖液包括三(羥甲基)氨基甲烷和雙甘肽，pH為7.8-8.4；所述酶提取液為由三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸制備的緩沖液；所述底物為L-γ-谷氨酰-4-硝基苯胺，所述標準品為對硝基苯胺，所述溶解稀釋液為酸性DMSO。

2.根據權利要求1所述γ-谷氨酰轉肽酶檢測試劑盒，其特征在于，所述基質緩沖液中的三(羥甲基)氨基甲烷的濃度為0.1-0.2mol/L，所述雙甘肽的濃度為0.05-0.15mol/L。

3.根據權利要求1所述γ-谷氨酰轉肽酶檢測試劑盒，其特征在于，所述酶提取液中的三(羥甲基)氨基甲烷的濃度為0.08-0.2mol/L。

4.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述底物的質量為10-20mg，經溶解稀釋液溶解后，底物溶液的濃度為10-20mmol/L。

5.一種測定γ-谷氨酰轉肽酶活力的方法，其特征在于，所述方法為非疾病的診斷和治療目的，使用權利要求1所述γ-谷氨酰轉肽酶檢測試劑盒，具體包括如下步驟：

S1、用酶提取液處理血清、血漿、組織或細胞樣品，得待測樣本并檢測其總蛋白濃度C_pr；

S2、將底物用溶解稀釋液溶解得到底物溶液，再與m倍體積的基質緩沖液混合得到反應工作液；將標準品用溶解稀釋液溶解得到一系列不同濃度的標準品溶液，再分別與m倍體積的基質緩沖液混合得到一系列不同濃度的標準品工作液；

S3、酶標板上設置標準孔和測定孔，標準孔中加入V₂ 體積的雙蒸水，測定孔中加入V₂體積的稀釋f倍的待測樣本；再向標準孔中加入V₃ 體積的標準品工作液，向測定孔中加入V₃體積的反應工作液，混勻；

S4、在溫度T下孵育，酶標儀405nm測定兩個固定時間點的OD值并計算變化值△A；

S5、繪制標準曲線，并通過以下公式計算酶活，γ-谷氨酰轉肽酶活力的計算方式具體如下：

待測樣本為組織或細胞樣本時，采用式(1)

γ-GT酶活(U/gprot)＝(△A-b)÷a×V₁ ÷V₂ ÷C_pr ÷T×f(1)

待測樣本為血清或血漿時，采用式(2)

γ-GT酶活(U/L)＝(△A-b)÷a×V₁ ÷V₂ ÷T×f(2)

其中，a為標準曲線的斜率，b：標準曲線截距，V₁ ＝V₃/(m+1)，所述式(1)中酶活的定義為：溫度T下，每克蛋白每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺的酶量為1個活性單位；所述式(2)中酶活的定義為：溫度T下，每升液體樣本每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺的酶量為1個活性單位。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S2所述m為2-6。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S3所述待測樣本加樣時，應觸酶標板底緩慢加樣。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S4所述溫度T為32-40℃，所述兩次孵育時間間隔為3-10min。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S4所述溫度T為37℃，孵育過程具體為：37℃恒溫箱中孵育1min，波長405nm處測定OD值，記為A₁ ；再放入37℃恒溫箱中準確孵育5min，波長405nm處測定OD值記為A₂ ；△A＝A₂ -A₁。