[發明專利]一種提取降纖酶前提原料的制備方法

在審

• 申請號: 202011433916.8
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112322605A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 郜金財;趙愛軍;王建庚;閆觀萍;董天文;曹利娟
• 申請（專利權）人: 河南天致藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64
• 代理公司: 鄭州科碩專利代理事務所(普通合伙) 41157
• 代理人: 汪鎮

本發明涉及醫藥技術領域，特別涉及一種提取降纖酶前提原料的制備方法，該方法包括多步陰離子交換層析以及疏水層析等多次不同原理的層析分離，并對分離后的液體進行病毒滅活處理，提高其純度和安全性，此外，這種制備方法縮短了分離提純降纖酶的周期，提高了生產效率，從而提高了其在市場中的競爭力。

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種提取降纖酶前提原料的制備方法。

背景技術

降纖酶是由多組分的蝮蛇抗栓酶經過提取、純化而成的單組分的新的蛇毒酶類，其分子量較小，從而避免了多組分抗栓酶可能出現的神經毒性與出血的不良反應，其由17種氨基酸、263個殘基組成，性能穩定，同時，降纖酶的抗凝血作用很強，能夠顯著地增強纖溶系統性和活力，降低血小板聚集，對實驗性血栓形成有防治作用，因此具有溶解血栓、抑制血栓形成，改善微循環、促進神經細胞恢復的作用，在臨床上降纖酶主要用于急性腦梗死、改善各種閉塞性血管病、改善末梢及微循環障礙。

目前，國內外公開的降纖酶的制備方法較多，但這些制備方法的收率均較低，這就導致其活性低、染菌污染的風險較大。

發明內容

本發明提供了一種提取降纖酶前提原料的制備方法，以解決目前降纖酶提取過程中收率低的問題。

本發明所采用的技術方案是：一種提取降纖酶前提原料的制備方法，包括至少以下步驟：

步驟1：將10 g蛇毒溶于緩沖液A中，離心，將上清液收集于潔凈瓶中；

步驟2：將步驟1中所收集的上清液以一定的速度上樣于A柱中，并用緩沖液B在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩，然后用緩沖液B經梯度洗脫后將具有酶活性的蛋白峰溶液收集至潔凈瓶中；

步驟3：將步驟2中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定條件下經超濾器超濾濃縮，并用B柱緩沖液A清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟4：將步驟3收集的液體以一定的流速上樣于B柱，并用緩沖液C在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩，然后用緩沖液C進行梯度洗脫，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步驟5：將步驟4中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定條件下經超濾器超濾，并用C柱緩沖液D清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟6：將步驟5中超濾置換后的溶液以一定的流速上樣于C柱，并用緩沖液C在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩，然后用緩沖液C進行梯度洗脫，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步驟7：將步驟6收集的具有酶活性的蛋白峰溶液分次裝入超濾器中，并在一定條件下超濾濃縮，并用D柱緩沖液D清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟8：將步驟7中超濾置換后的液體以一定流速上樣于D柱，用緩沖液E在一定流速下進行洗脫，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，即得精品降纖酶溶液；

步驟9：將步驟8中得到精品降纖酶溶液裝入超濾器中，并在一定條件下超濾置換，在超濾置換過程中，在超濾器中加入適量的注射用水，且重復超濾置換三次，然后用適量的注射用水清洗收集，接著將所得的收集液混合均勻，即得降纖酶溶液，計量體積。

優選地，將步驟9制得的降纖酶溶液經20nm的過濾膜過濾以進行病毒滅活，收集經病毒滅活的濾液并計量體積，然后取樣送檢、密封、貼標簽并在0-10℃下保存備用。

優選地，緩沖液A為pH值為6.0-6.5、0.1M 的Tris緩沖液；

緩沖液B為含有0.2M NaCl、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris緩沖液；

緩沖液C為含有0.5M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸鈉緩沖液；

緩沖液D為含有0.1M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸鈉緩沖液；