[發(fā)明專利]一種提取降纖酶前提原料的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011433916.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112322605A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郜金財(cái);趙愛(ài)軍;王建庚;閆觀萍;董天文;曹利娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南天致藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/64
• 分類號(hào): C12N9/64
• 代理公司: 鄭州科碩專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41157
• 代理人: 汪鎮(zhèn)

1.一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于，包括至少以下步驟：

步驟1：將10 g蛇毒溶于緩沖液A中，離心，將上清液收集于潔凈瓶中；

步驟2：將步驟1中所收集的上清液以一定的速度上樣于A柱中，并用緩沖液B在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩(wěn)，然后用緩沖液B經(jīng)梯度洗脫后將具有酶活性的蛋白峰溶液收集至潔凈瓶中；

步驟3：將步驟2中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定條件下經(jīng)超濾器超濾濃縮，并用B柱緩沖液A清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟4：將步驟3收集的液體以一定的流速上樣于B柱，并用緩沖液C在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩(wěn)，然后用緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步驟5：將步驟4中收集的具有酶活性的蛋白峰溶液在一定條件下經(jīng)超濾器超濾，并用C柱緩沖液D清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟6：將步驟5中超濾置換后的溶液以一定的流速上樣于C柱，并用緩沖液C在一定流速下等度洗脫至紫外基線平穩(wěn)，然后用緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，并收集具有酶活性的蛋白峰溶液；

步驟7：將步驟6收集的具有酶活性的蛋白峰溶液分次裝入超濾器中，并在一定條件下超濾濃縮，并用D柱緩沖液D清洗收集至潔凈瓶中備用；

步驟8：將步驟7中超濾置換后的液體以一定流速上樣于D柱，用緩沖液E在一定流速下進(jìn)行洗脫，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，即得精品降纖酶溶液；

步驟9：將步驟8中得到精品降纖酶溶液裝入超濾器中，并在一定條件下超濾置換，在超濾置換過(guò)程中，在超濾器中加入適量的注射用水，且重復(fù)超濾置換三次，然后用適量的注射用水清洗收集，接著將所得的收集液混合均勻，即得降纖酶溶液，計(jì)量體積。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于：將步驟9制得的降纖酶溶液經(jīng)20nm的過(guò)濾膜過(guò)濾以進(jìn)行病毒滅活，收集經(jīng)病毒滅活的濾液并計(jì)量體積，然后取樣送檢、密封、貼標(biāo)簽并在0-10℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于：

緩沖液A為pH值為6.0-6.5、0.1M 的Tris緩沖液；

緩沖液B為含有0.2M NaCl、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris緩沖液；

緩沖液C為含有0.5M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸鈉緩沖液；

緩沖液D為含有0.1M NaCl、pH6.5～7.0、0.5M 的乙酸鈉緩沖液；

緩沖液E為含有0.5M 硫酸鹽、pH6.0～6.5、0.1M 的Tris緩沖液；

A柱采用DEAE-Sepharose F.F層析柱；B柱采用UniGel-DEAE層析柱；C柱采用UniCore-DEAE層析柱；D柱采用NanoHR Pheny層析柱。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于：步驟1中離心時(shí)轉(zhuǎn)速為5000RPM，離心時(shí)間為10min；步驟2中上清液以8-12ml/min的速度上樣于A柱中，緩沖液B的濃度為10%，并在14-16ml/min的流速下進(jìn)行等度洗脫，緩沖液B以10%-100%的梯度進(jìn)行洗脫，梯度洗脫速度為14-16ml/min，梯度洗脫時(shí)間為200-240min。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于：步驟1-步驟9中所用到的超濾器均采用分子量不大于10KDa的超濾膜，且在氮?dú)夥諊乱?.2-0.4MPa的壓力進(jìn)行超濾濃縮，步驟3中超濾濃縮后液體體積不大于20ml，然后用150-200ml的緩沖液A清洗收集；步驟5中超濾濃縮后液體體積不大于15ml，然后用80-100ml緩沖液A清洗收集；而步驟7中超濾濃縮后液體體積不大于10ml，然后用60-80ml緩沖液A清洗收集。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提取降纖酶前提原料的制備方法，其特征在于：步驟4中將步驟3收集的液體以8-12ml/min的流速上樣于B柱，并用30%的緩沖液B在14-16ml/min的流速下等度洗脫至紫外基線平穩(wěn)，然后用緩沖液B以30%-100%的梯度進(jìn)行洗脫，洗脫速度為14-16ml/min，梯度時(shí)間為160-200min。