[發明專利]一種基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法

在審

• 申請號: 202011433678.0
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112213484A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 徐慧敏;盧曉楠;于萍萍;王美君;湯波;韓昱鵬;劉飛;劉奇;張淵魁;王敏
• 申請（專利權）人: 北京科牧豐生物制藥有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司北京生物醫藥科技中心;兆豐華生物科技（福州）有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 北京金蓄專利代理有限公司 11544
• 代理人: 洪濤

1.一種基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）取待測的豬肺炎支原體滅活疫苗和經檢驗的參考疫苗，備用；

（2）將純化的豬肺炎支原體包被抗原用包被液進行稀釋，加至酶標板中進行包被處理，結束后洗板，并加入封閉液進行恒溫培養箱孵育，洗板后備用；

（3）將不同來源的待測疫苗和參考疫苗分別加入上述處理后的酶標板不同的孔中，并在另外的空白孔中分別加入檢測一抗、標準陰性血清、標準陽性血清及空白對照；

（4）將上述加樣后的酶標板置于恒溫培養箱孵育，洗板后各孔分別加入HRP標記的酶標檢測二抗，進行恒溫培養，洗板后加入顯色液，于室溫避光孵育后，加入終止液以終止反應；

（5）將各孔反應液于450nm條件下測定其OD值，并將經過計算后的OD_450nm值輸入RelPot4.0軟件計算RP值，以獲得抗原含量之間的數值關系值以及數值關系圖，以判斷疫苗的體外相對效力是否合格。

2.根據權利要求1所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，所述參考疫苗為經檢驗合格的攻毒試驗最小保護量抗原的疫苗。

3.根據權利要求2所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（2）中：

控制所述豬肺炎支原體的稀釋濃度為20±5μg/ml，控制加液量為100μl/孔，控制所述包被處理的步驟的溫度為4℃包被16-18小時；

控制所述封閉液的加液量為100μL/孔，于37±2℃恒溫培養1-2小時。

4.根據權利要求3所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，所述待測疫苗和所述參考疫苗的加液量為200μl/孔。

5.根據權利要求4所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（3）中：

所述檢測一抗為PBS稀釋的兔抗豬肺炎支原體陽性血清；

所述標準陰性血清為PBS稀釋的兔抗豬肺炎支原體陰性血清；

所述標準陽性血清為PBS稀釋的兔抗豬肺炎支原體陽性血清；

所述空白對照為PBS。

6.根據權利要求5所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，還包括將所述參考疫苗和/或待測疫苗進行梯度稀釋后加入至所述酶標板中進行不同濃度檢驗的步驟。

7.根據權利要求6所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，所述稀釋梯度為原倍、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128的2倍系列倍比稀釋所得。

8.根據權利要求7所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（4）中：

所述酶標檢測二抗為PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，加液量為100μl/孔；

所述顯色液的加液量為100ul/孔；

所述終止液的加液量為50ul/孔。

9.根據權利要求1-8任一項所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（5）中，試驗有效性判定包括：

A：陽性對照OD_450nm平均值應在0.7-2.0范圍之內；

B：陰性對照OD_450nm平均值應＜0.4；

C：試驗無效標準：如果上述標準中有一條不符合，試驗無效。

10.根據權利要求9所述的基于ELISA法檢驗豬肺炎支原體滅活疫苗體外效力的方法，其特征在于，所述步驟（5）中，疫苗合格的判定標準為：

A：符合試驗有效標準；

B：設定參考疫苗RP值為1.0，待檢疫苗RP值應≥1.0，待檢疫苗相對效力合格；

C：如待檢疫苗RP值＜1.0，應重檢1次；待重檢結果的RP值≥1.0，判待檢疫苗相對效力合格，否則判待檢疫苗相對效力不合格。